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1、组织蛋白酶D与兔椎间盘退变相关性研究摘要：目的 采用椎间盘内注射不同浓度的组织蛋白酶D，探讨组织蛋白酶D在兔椎间盘退变中的作用。方法 健康大白兔60只随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组，实验组分为三个亚组，椎间盘内注射3种不同浓度的组织蛋白酶D，阴性对照组中在椎间盘内注射生理盐水，空白对照组不做任何处理。分别于术后3、6w，检测椎间盘髓核中蛋白多糖含量，采用HE染色组织学观察椎间盘的退变特征。结果 HE染色组织学观察6w时在实验组及阴性对照组椎间盘中，组织学观察到不同程度的椎间盘退变特征：?l核脊索细胞逐渐减少，并逐渐被纤维软骨组织替代，纤维环与?l核之间失去明显的界限。蛋白多糖含量的测定
2、显示：6w时各实验组蛋白多糖含量下降程度大于阴性对照组（P0.05）。结论 组织蛋白酶D可导致兔腰椎间盘内蛋白多糖含量的降低，说明组织蛋白酶D在椎间盘退变过程中可能起重要作用。 /1/view-12282570.htm关键词：椎间盘退变；组织蛋白酶D；蛋白多糖椎间盘退变是有关腰椎疾病的病理基础。研究表明， 椎间盘退变有多种因素的参与。最近研究表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用，除基质金属蛋白酶（MMPs）外，组织蛋白酶（Cathepsins）也是能够降解胶原和粘蛋白的蛋白水解酶。有研究表明在突出的人腰椎间盘中有组织蛋白酶D的表达1，但组织蛋白酶D是否参与椎间盘退变的过程未明确，为此本
3、实验通过动物实验来初步了解组织蛋白酶D与椎间盘退变的关系。1 资料与方法1.1实验动物 60只健康大白兔， 雄性， 68个月龄， 体重2.53.0 kg， 由长江大学动物实验中心提供。1.2试剂及仪器 组织蛋白酶D购自德国默克尔生物技术有限公司，微量注射器购自上海高鸽工贸有限公司。1.3动物模型及分组 60只健康大白兔， 随机分为实验组36只， 阴性对照组12只，空白对照组12只。实验组再分成3组：实验组A注射组织蛋白酶D的浓度为10ng/D、实验组B注射组织蛋白酶D的浓度为50ng/D、实验组C注射组织蛋白酶D的浓度为100ng/D，每组8只。实验组及阴性对照组用10%水合氯醛20 mg/K
4、g静脉麻醉后， 取俯卧体位，备皮， 碘酒、酒精消毒， 铺巾。在兔脊柱右侧剃毛备皮约20cm15cm，常规消毒、铺巾，取右侧卧位， 沿左侧12 肋末向下至髂脊做纵切口， 可见胸腰筋膜后层， 向内包被骶棘肌， 表面呈白色腱膜状， 其外为腹外斜肌起点。切开胸腰筋膜后层， 在骶棘肌和腰方肌的外缘与胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘， 可触及横突， 以第12肋定位暴露第四腰椎（D4）横突，在根部去除此横突，可显露椎体和椎间盘，显露D3/4、D4/5椎间盘，1uD微量注射器吸入组织蛋白酶D或生理盐水，然后用弯钳挟持1uD微量注射器针头，尖端保留5mm长度，于纤维环前外侧平行于终板向椎间盘中央刺入，深度
5、控制在5mm，然后将组织蛋白酶D或生理盐水推入椎间盘内。术前及手术结束时肌注庆大霉素8万U。术后分别于3w、6w处死动物取材。1.4组织学观察 每组标本均取D3/4椎间盘组织学检查。将标本置于10%中性福尔马林液固定48h，在SchmorD 氏脱钙液中脱钙5d 以上，至完全脱钙，流水冲洗24h，逐级脱水和浸蜡，石蜡包埋，切制5m石蜡切片，HE 染色，光镜下观察。1.5椎间盘内蛋白多糖的测定 每组标本均取D4/5椎间盘做蛋白多糖含量的测定，采用Bitter 法测定蛋白多糖含量，取椎间盘髓核组织，用丙酮、乙醚脱脂。取10mg脱脂髓核用木瓜酶消化，加入20 %三羧酸，离心后取上清加水，加入浓硫酸，振
6、荡后水浴，加入咔唑，测535 nm的吸光值，换算出蛋白多糖含量。1.6统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行分析，检验标准P0.05具有统计学意义。统计方法，组内用方差分析。多组数据之间均数比较采用方差分析，多组数据之间均数两两比较采用DSD检验，两组数据之间均数比较采用t检验。检验水准?=0.05，双侧检验。2 结果2.1 HE染色显示 在3w时各组椎间盘及6w空白对照组椎间盘中（图1），纤维环仍保持着致密的板层结构，细胞成分较多，呈梭形纤维细胞样或呈软骨细胞样。在6w阴性对照组及6w各实验组中（图1），各标本均表现出一定的退变特征：?l核脊索细胞逐渐减少，并逐渐被纤维软骨组织替代，纤
7、维环与?l核之间失去明显的界限。且在实验组与阴性对照组比较显示了更多的髓核毛细血管侵入和炎性细胞浸润，髓核及纤维环退变更严重，纤维细胞增生及瘢痕形成。图1 各组兔椎间盘组织的HE染色 （100）A：空白对照组；B：阴性对照组；C：实验10ng/uD组；D：实验50ng/uD组；E：实验100ng/uD组2.2椎间盘内蛋白多糖的测定 蛋白多糖含量的测定显示6w时实验组蛋白多糖的含量与空白对照组及阴性对照组之间的差异较显著（P0.05）；6w时在各实验组之间，注射组织蛋白酶D浓度为100ng/uD组的蛋白多糖含量低于50ng/uD、10ng/uD组（P0.05）。各组椎间盘蛋白多糖含量经过方差分析
8、后结果如下（见表1）。3 讨论椎间盘退行性变是腰腿痛的重要原因之一。椎间盘退变的机制较为复杂， 目前研究2认为椎间盘的退变表现在其基质和细胞成分的变化，而椎间盘细胞稀少，基质丰富，因此椎间盘的退变主要表现在构成基质的胶原和蛋白多糖等生物大分子的结构、功能、含量和类型的变化，其中蛋白多糖含量的降低是椎间盘退变的最早变化之一。另有研究3，4表明降解的蛋白多糖可激活一些细胞活性因子，这些小分子蛋白通过复杂的网络调节，反过来又促进椎间盘的退变。至于蛋白多糖的降解，目前研究5表明在影响其降解的诸多因素中蛋白水解酶较为重要。 组织蛋白酶（Cathepsin）通常指一类在酸性环境中被活化的溶酶体蛋白水解酶，
9、 因其催化中心不同而分为半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。本实验所研究的组织蛋白酶D属于半胱氨酸蛋白水解酶，为一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，其分子量为30KD。有研究表明组织蛋白酶D在骨基质降解过程中起重要作用7。目前研究表明在突出的人腰椎间盘中有组织蛋白酶D的表达1，但组织蛋白酶D是否参与椎间盘退变的过程未明确。研究8已证实正常的椎间盘组织内pH值为6.97.2；由于代谢产物的影响， 椎间盘内部的pH值可以降低到6.1以下，这不仅损害了细胞的新陈代谢，影响细胞的生物合成功能，还为酸性蛋白酶类发挥细胞外蛋白水解酶作用、降解细胞外基质提供了适宜条件。而组织蛋白酶D作用的最适pH值为偏酸
10、性。本实验结果显示各实验组蛋白多糖含量下降程度大于阴性对照组（P0.05），说明组织蛋白酶D能引起蛋白多糖含量下降。且实验组HE染色结果与对照组比较，显示出明显的退变特征：?l核脊索细胞逐渐减少，并逐渐被纤维软骨组织替代，纤维环与?l核之间失去明显的界限。由本实验所得结果可见组织蛋白酶D可导致兔腰椎间盘内蛋白多糖含量的降低及?l核脊索细胞减少，说明组织蛋白酶D在椎间盘退变过程中可能起重要作用。参考文献：1智春升，谢林.组织蛋白酶D与人腰椎间盘退变关系的研究J.中国矫形外科杂志，2008，16（5）：365-368.2胡明，张传森.退变椎间盘细胞外基质的改变J.解剖手术学杂志，2004，13（1
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