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1、 本科生毕业设计(论文)中文题目龙牙百合在组织培养过程中的酶谱分析 外文题目 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture 学号 0507040099 姓名 彭 静 学院生 命 科 学 学 院 专业生 物 科 学 指导教师 完成时间2009-4-30 江西师范大学教务处制目录摘 要1Abstract21 文献综述31.1龙牙百合的生物学特征及价值31.1.1龙牙百合的生物学特征31.1.2龙牙百合的价值31.2龙牙百合在组织培养过程中过氧化物酶活性变
2、化的研究现状31.3国内外同工酶研究现状及应用41.4 研究的目的和意义42 实验材料、主要仪器与试剂42.1实验材料52.2实验主要仪器52.3实验试剂53 实验方法53.1技术路线53.2培养基及培养条件53.3确定上样量63.4电泳64试验结果及分析84.1组织培养过程中龙牙百合生长与分化情况84.2过氧化物酶同工酶与龙牙百合生长分化的关系95讨论96对下一步工作的建议10参考文献11附图12致 谢15I摘 要在组织培养过程中，为研究龙牙百合生长分化与过氧化物酶同工酶的关系，对龙牙百合进行组织培养并采用聚丙烯酰胺不连续体系盘状电泳(垂直管电泳)分离不同阶段过氧化物同工酶。结果：在龙牙百合
3、生长分化过程及不同组织过氧化物酶同工酶酶谱有很大差异，过氧化物酶同工酶酶谱可作为判别龙牙百合生长分化进程的依据。关键词：龙牙百合,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,过氧化物酶同工酶 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture PENG JingAbstractIn the process of the tissue culture, a study on the relationship between the growth and differentia
4、tion and Peroxidase isozyme of Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was carried out . Tissue Culture for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was taken , To separate Peroxidase isozyme under different stages , the discontinuous system of discoid spolyacrylamide gel electrophoresis (vertical tu
5、be gel electrophoresis) was used. And the result showed that there was a great difference of map of peroxidase isoenzyme in the process of the growth and differentiation and among different tissues. The map may be as a basis for determination of the course of differentiation.Key words：LilumbrowniiF.
6、E Browh Var virdum baker, polyacrylamide gel electrophoresis, Peroxidase isozyme171 文献综述1.1龙牙百合的生物学特征及价值1.1.1龙牙百合的生物学特征龙牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)为百合科百合属中能形成鳞茎的栽培品种, 多年生宿根草本植物。鳞茎近球形, 横茎24.5cm，鳞片披针形, 白色, 无节, 味淡不苦。根系由肉质根和纤维状根组成, 肉质根又叫“ 下盘根” , 着生于鳞茎下部；纤维状根又叫“上盘根” , 着生在鳞茎上部。叶散生, 倒披针形。花
7、乳白色有香气, 一般称白花百合。龙牙百合喜凉爽, 耐荫蔽, 喜湿润, 怕水涝, 10以上可以萌发生苗, 生长适温为1624, 土层深厚、PH值5.76.3。排水良好的砂质壤土最适宜生长1。龙牙百合以其干品瓣形肥大微弯，色泽洁白至宝黄，形似龙牙而著称。1.1.2龙牙百合的价值 龙牙百合是一类药食同源、有较高经济价值的特产蔬菜和药用植物。龙牙百合以鳞茎入药 ,为常用中药 ,也可供提取淀粉或食用。龙牙百合含多种氨基酸、蛋白质、淀粉、磷脂、百合苷 A、B等抗癌性植物碱及维生素 B1、B2等营养物质 ,具有润肺止咳、宁心安神、清热解毒等作用 ,性微寒、味甘 ,是目前市场走俏的药用保健食品2。具有养阴润肺
8、止咳，清心安神功用；主治阴虚燥咳，劳嗽咯血、肺瘘、虚热、烦噪惊悸、失眠、多梦等；有镇咳、平喘、祛痰、抗疲劳、镇静、催眠、提高免疫力，升高外周白细胞等药理作用。龙牙百合是最名贵的一种百合，它内含丰富的生物碱，蛋白质，矿质元素等，是食品中的珍品，由开其价格昂贵，被奉为贵族食品。近几年,我国百合产量增加较快,经济效益显著3。1.2龙牙百合在组织培养过程中过氧化物酶活性变化的研究现状在龙牙百合的组织培养过程中，植物过氧化物酶以其广泛存在和特殊的生物学意义而引起日益深入的研究4。龙牙百合组培过程中对过氧化物酶活性变化的研究和其他百合属植物一样，一般都是通过测定植物发育不同时期内的过氧化物酶活性变化规律,
9、来研究植物的组织分化状况5。过氧化物酶与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系6。在植物的代谢过程中它可以除去过多的H2O2，从而维持正常生理过程，避免了H2O2的毒害7。因此，研究过氧化物酶活性变化是非常必要。有许多公司、研究中心在过氧化物酶活性方面作了大量工作，并取得了较好的成就。1.3国内外同工酶研究现状及应用同工酶的研究得到了很大发展，同工酶在植物体内调节一定的代谢过程，因此，常被用于细胞分化、器官发生及个体发育过程中基因表达的研究，从同工酶的器官组织特异性也反映了基因表达的时空特异性。过氧化物同工酶在各种动物体内广泛存在9，而且在某些动物的不同器官组织内酶谱存在一定的差异。研究分
10、化进程及其与过氧化物酶同工酶的关系，可以进一步深入探索龙牙百合生长分化的基因表达差异，为龙牙百合生长分化调控提供理论指导。酶谱的变化已作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标10。而且由于同工酶是基因的产物，能直接反映基因的异同，易于观察研究，目前已作为一种分化遗传分化标志广泛地应用于发育生物学、群体依次学、医学、分类学等各个领域。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存11 12。但至今尚未见到有关龙牙百合生长分化状况与过氧化物同工酶关系的研究。1.4 研究的目的和意义1.4.1研究目的在组织培养过程中，过氧化物酶同工酶不断发生变
11、化13。通过比较不同阶段过氧化物同工酶谱的差异，来研究龙牙百合生长分化与过氧化物酶同工酶的关系。1.4.2研究意义作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的生长分化研究中有重要的意义。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的同工酶14，可以反映某一时期植物体内代谢的变化，研究分化进程及其与过氧化物酶同工酶的关系，可以进一步深入探索龙牙百合生长分化的基因表达差异，为龙牙百合生长分化调控提供理论指导15 16。2 实验材料、主要仪器与试剂2.1实验材料涂艺声教授细胞实验室培养的龙牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum
12、baker)无菌苗。每隔10天对龙牙百合的茎段取一次样。2.2实验主要仪器垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）、稳压稳流直流电泳仪、高速冷冻离心机、电子分析天平2.3实验试剂见附表4 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法，但染色使用醋酸联苯胺染色。醋酸联苯胺染色：0.1g联苯胺+5ml无水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸钠+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的双蒸水。溶解并过滤待用。胶片用双蒸水冲洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶带完全出现后（约20min），用自来水冲洗2-3次，再隔一天换一次水，总共换2-3次。3 实验方法3.1技术路线本实验拟采取
13、如下技术路线：无菌苗外植体接种培养不连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶酶谱分析(定期观察龙牙百合的培养情况,看其生长势态，同时测定过氧化物和硝酸还原酶活性,做纪录)3.2培养基及培养条件本试验采用的基本培养基是MS培养基，其配方查阅有关的资料，另外附加6一BA、NAA植物激素。蔗糖分别为每升培养基30g，琼脂每升培养基 5.8 g，pH 为5.8 ，在容量为200ml的三角瓶中装入50ml，并以高压蒸汽灭菌锅 在118下灭菌25分钟，培养温度为(25+2),光照度为1500lx,光照12 h/d。 表1 2种培养基成分Table 3 culture medium ingredie
14、nt培养基编号培养基成分1号1/2MS基本培养基+BA 1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +20g/l 蔗糖2号1/2MS基本培养基+ BA1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +30 g/l 蔗糖3.3确定上样量 设置一系列量（ul）（5、7.5、10、12.5、15、17.5、20），点样在一块电泳板上，然后进行电泳，发现点样量为12.5ul和15ul的图谱最清晰，所以上样量确定为12.515ul.3.4电泳17参照参考文献13中聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶。用10倍pH8.3的Tris甘氨酸缓冲液，分离胶采用过硫酸铵TEMED催化系统，pH8.9，凝胶总浓度T7.1%，浓缩胶采用核黄素TEMED催化系统，pH6.7、T3.1%，电极缓冲液为pH8.3Tris甘氨酸系统。加
