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1、实验八 食品中含菌总数的检测（新修改）一、实验目的1.掌握食品安全国家标准GB 4789.22010食品微生物学检验菌落总数测定方法。2.掌握国家标准GB 4789.22010菌落总数的计算方法与报告方式。3.学习食品中检验菌落总数的意义与方法。二、实验原理菌落总数 aerobic plate count，食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。PCA平板分离法：该方法操作简便，其基本原理：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母膏粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。选择恒温36 1 培养48 h2 h（水产品
2、30 1 培养72 h3 h）普遍用于微生物的分离与纯化。检样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择23 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内每皿中加入15 mL20 mL平板计数琼脂培养基，混匀培 养计数各平板菌落数计算菌落总数报 告图 菌落总数的检验程序三、实验步骤四、实验结果（结果可手写或者打印粘贴）2009食品集团有限公司一/二分公司产品检验原始记录（菌落总数）（每组检测3个样品，模拟）（一/二分公司=1/2班） 第n组 2010年 月 日品名1生产批号规格型号检验员感官评测色泽：形态：组织：气滋味： 杂质：菌落总数(GB 4789.
3、2-2010)稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU平均数报告值（APC）培养条件培养温度培养时间备注：品名2生产批号规格型号检验员感官评测色泽：形态：组织：气滋味： 杂质：菌落总数(GB 4789.2-2010)稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU平均数报告值（APC）培养条件培养温度培养时间备注：品名3生产批号规格型号检验员感官评测色泽：形态：组织：气滋味： 杂质：菌落总数(GB 4789.2-2010)稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU平均数报告值（APC）培养条件培养温度培养时间备注：五、讨论分析1.试简述GB 4789.2-2010菌落形成单位（colony-
4、formingunits,cfu）的计算方法与报告方式 （参考GB 4789.2-2010 7 结果与报告 缩写）2.试简述食品中细菌数量的食品卫生学意义一是可作为食品被微生物污染程度的标志。食品中细菌数量越多，说明食品被污染的程度越重、越不新鲜、对人体健康威胁越大。相反，食品中细菌数量越少，说明食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好。在我国的食品卫生标准中，针对各类不同的食品分别制定出了不允许超过的数量标准，借以控制食品污染的程度。二是可以用来预测食品可存放的期限，食品中细菌数量越少，食品可存放的时间就越长，相反，食品的可存放时间就越短。由于食品的性质、处理方法及存放条件的不同，以致对食品卫
5、生质量具有重要影响的细菌种类和相对数量比也不一致，因而目前在食品细菌数量和腐败变质之间还难于找出适用于任何情况的对应关系。同时，用于判定食品腐败变质的界限数值出入也较大。六、改进实验建议实验九 食品中大肠杆菌群的检测（新修改）一、实验目的1.掌握食品安全国家标准GB 4789.3-2010 食品微生物学检验大肠菌群计数第二法大肠菌群平板计数法。2.了解食品中大肠杆菌群检测的意义。二、实验原理平板稀释分离：应用结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）与检样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3 mL4 mL VRBA覆盖平板表层，翻转平板置于36 1 培养18 h24 h培养。选取菌落数在15 CFU150 C
6、FU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大36148h2h36148h2h检样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择2个3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板计数典型和可疑菌落BGLB 肉汤报告结果图2 大肠菌群平板计数法检验程序证实试验：从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡杜汉氏发酵管BGLB肉汤产气，即可报告为大肠菌群阳性。三、实验步骤四、实验结果（结果可手写或者打印
7、粘贴）2009食品集团有限公司一/二分公司产品检验原始记录（大肠菌群） （每组检测3个样品，模拟） 第n组2010年 月 日品名1生产批号规格型号检验员大肠菌群(GB 4789.3-2010)第二法：大肠菌群平板计数法稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU典型菌落平均数（个）证实试验：10个不同类型的典型和可疑菌落于BGLB产气管数（管）报告值（CFU）培养条件培养温度培养时间备注：品名2生产批号规格型号检验员大肠菌群(GB 4789.3-2010)第二法：大肠菌群平板计数法稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU典型菌落平均数（个）证实试验：10个不同类型的典型和可疑菌落于BGLB
8、产气管数（管）报告值（CFU）培养条件培养温度培养时间备注：品名3生产批号规格型号检验员大肠菌群(GB 4789.3-2010)第二法：大肠菌群平板计数法稀释度10-？10-？10-？空白对照CFU典型菌落平均数（个）证实试验：10个不同类型的典型和可疑菌落于BGLB产气管数（管）报告值（CFU）培养条件培养温度培养时间备注：五、讨论分析1.大肠菌群指什么？分布有如何？大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴
9、性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。2.在本实验中，你是采用何标准与何步骤检测大肠菌群？参考 (GB 4789.3-2010)第二法：大肠菌群平板计数法 缩写三、步骤3.1、酒曲中酵母菌的分离（划线分离法和稀释涂布平板法）3.1.1 倒平板右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边
10、，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入PDA培养基约10 ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。3.1.2 稀释酒曲分别称取酒曲1g，放入盛49ml无菌水，考虑成本，本实验采用定性方法，在实际检测中应以5g，放入盛45ml无菌水）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使酒曲与水充分混合，将细胞分散。用一支1 ml无菌吸管从中吸取1ml酒曲悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 ml(无菌操作)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混
11、合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的酒曲溶液(注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管)。3.1.2.1涂布将上述每种培养基的3个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-63种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管酒曲稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒（或者棉签）平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置510min，使菌液浸入培养基。3.1.2.1平板划线分离法将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线
12、,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是DCBA。3.1.3 培养将培养基平板倒置于28温室中培养35 d，肉膏蛋白胨平板倒置于37温室中培养23d。 3.1.4挑取菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到PDA培养基斜面上，分别置于28和37温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。3.2食品微生物学检验菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法（GB 4789.2-2010)
13、（检验程序图可打印粘贴）样品：水、调味品、酱卤肉、蛋制品、饮料、糕点、面包、糖果、乳制品、水产食品、冷食菜、豆制品、罐头食品、酒、果蔬、粮谷制品、干果、膨化食品、保健食品、食用螺旋藻粉、婴幼儿食品等）（材料不限于此，报告中需要写明具体的检测样品）检样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择23 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 mL 分别加入无菌培养皿内每皿中加入15 mL20 mL平板计数琼脂培养基，混匀培 养计数各平板菌落数计算菌落总数报 告图 菌落总数的检验程序检样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质36148h2h10 倍系列稀释48h2h361选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST 肉汤管产气BGLB肉汤产气不产气大肠菌群阳性大肠菌群阴性查 MPN 表报告结果图1大肠菌群MPN 计数法检验程序3.3食品微生物学检验大肠菌群的检测方法（GB 4789.3-2010第一法：大
