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1、高效毛细管电泳及其在体内药物分析中的应用摘要 本文主要综述了高效毛细管电泳技术近年来研究进展及其在体内药物分析中的应用。关键词 高效毛细管电泳 体内药物分析 样品浓缩技术高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)又称毛细管电泳，指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间迁移率和或分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。此技术可分析的成分小至有机离子，大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPCE分析高效、快速、微量，与HPLC有并驾齐驱的趋势。1 H
2、PCE的几种经典分离模式HPCE可分析的成分小至无机离子，大至生物大分子，如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPCE分析高效、快速、微量。根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型：毛细管区带电泳(CZE)；毛细管等速电泳(CITP)；毛细管胶束电动色谱(MECC)；毛细管凝胶电泳(CGE)；毛细管等电聚焦(CIEF)。目前CZE和MECC用得较多，本文以这两种方法为例来说明HPCE的原理。1.1 CZE的基本原理HPCE选用的毛细管以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间浓度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在电
3、解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。HPCE所用的大理石英毛细管柱，在pH3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(E0F)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。1.2 MECC的基本原理MECC是把
4、一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)加到缓冲液中，当其浓度超过临界浓度后就形成有疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电，但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度，故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在二相中分配就有差异，疏水性强的和胶束结合牢，流出时间就长，最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使HPCE能用于中性物质的分离，拓宽了HPCE的应用范围，是对HPCE极大的贡献。2. 高效毛细管电泳应用中存在的缺陷及改进方法2.1定量精密度较差。在用毛细管电泳做定量检查时，所得数据的RSD值通常较大，常采用内
5、标法,以提高其定量精密度。如Davydova1等以氨基苯甲酸为内标法测定小鼠尿液、血浆中的碘他拉酸盐,结果测定低浓度碘他拉酸盐时,5份样品的准确度为98.0%,RSD为6.4%,测定高浓度时,准确度为99.7%,RSD为0.8%。2.2 灵敏度较低。在用毛细管电泳法对样品痕量物质的检查时，一方面组分浓度较小，另一方面检测器，进样方法的差限，导致灵敏度较低。随HPCE的不断完善,提高灵敏度的措施也愈来愈多。目前，提高毛细管电泳检测灵敏度的措施主要有3种2：样品的预处理采用更高灵敏度的检测器，采用样品浓缩技术。2.2.1样品的前处理 样品的前处理是提高灵敏度的重要措施，在体内药物分析中,常见的样品
6、有血浆、血清、尿液和头发等,为避免样品中的蛋白质和盐等基质对分析测定的干扰,常需对样品进行预处理。HPCE对样品的预处理要求,没有HPLC和GC那么严格。常用的预处理方法有沉淀法和萃取法。沉淀法中，当待测物浓度足够大时,可离心进样或经简单离心过滤后进样。若样品中含盐和蛋白质,可用在柱微渗析或小孔聚丙烯酰胺凝胶将待测物与上述基质分离。待测物分子较小且与高浓度蛋白质混合时,可用超滤法或排阻色谱法分离。萃取法主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE),这2种萃取方法都是基于待测物质在两相之间分配行为的差异,都适用于基质干扰较大,待测组分数量较多,尤其是含脂溶性成分较多的样品。也有将液-液萃取与固
7、相萃取相结合,在消除样本中杂质的同时,可以提高检测灵敏度,如测定血清中R-和S-司可巴比妥3的含量就采用此法。其最低检测限(LOD)达到1g/mL。2.2.2 样品浓缩技术的采用样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离，从而提高检测灵敏度的一种技术 ,毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分。柱上浓缩是改变毛细管电泳系统时进行，特大体积样品直接引入分离色细管后，在电泳前采取适当的措施进行浓缩，然后直接进电泳分离；柱前浓缩是在改变毛细管电泳系统时进行 一般往分离毛细管前增加一段预柱，大体积样品首先被引人预柱中采取适当措施进行浓缩，然后部分或全部被引入
8、分离毛细管柱中进行分离。Eap等4采用FASS技术对血样中的四类抗抑郁药物进行富集，测定了米安色(mianserin)、去米安色林、8一羟基米安色林及其对映体的血药浓度。在进样前以流体动力进样法引入一小段水柱，加压到5kV后该区场强增高，使待测物快速迁移入毛细管。在水柱和背景电解质交界处进行富集。米安色林和去甲米安色林的LOQ为5LgL，8一羟基米安色林的LOQ为15LgL检测快速，适用于治疗药物监测。2.2.3 采用更高灵敏度的检测器CE常用紫外-可见检测器，但是检测光程受毛细管内径的限制,毛细管内径小于100um，检测光程短，当采用一般通用型紫外检测器时，灵敏度只能达到10-6mol/L5
9、。常用的紫外检测器的检测浓度一般要求样品的进样浓度在10-5mol/L以上，这对于纯药品的测定或实验室进行的研究来说或许不成问题,但在实际应用中, 药品中杂质的含量大都只在0.1 %左右,浓度过低,难以达到被检测的水平6。除紫外-可见检测器外，近年来，CE采用了激光诱导荧光检测器，它是CE中最灵敏的检测器。另外还有质谱检测器，质谱检测器与其他检测器相比是一种更为通用型检测器，它的选择性和专属性弥补了CE中样品迁移时间变化的不足，能给出分子量和结构信息，使检测具有二维性。最近我国开发的固液化学发光体系7使CE 的在柱检测灵敏度提高到10-8 mol/L ,并成功地应用于分离和检出ABEI 标识的
10、氨基酸。2.2.4 改善CE的检测方法来提高分析灵敏度也是一项受人关注的研究,如扩大毛细管检测部位的体积或延长毛细管的吸收光路可以使检测灵敏度提12个数量级8。除了以上几种方法用于改进毛细管电泳的灵敏度外，一些新型的分离模式的出现，比如毛细管管电色谱，也大大提高了检测的灵敏度。3 HPCE与体内药物分析药物分析大致可分为二大部分:一是原药的定量,原药中不纯物的测定、药剂的分析以及对它们的稳定性的评价等以药品质量管理为目的的测试方法。这些方法要求有良好的选择性,适当的分析灵敏度和可靠的准确度等。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究,即临床药物分析。这里我们主要讲
11、体内药物分析部分。3. 1 治疗药物检测 维生素 维生素是人体机能不可缺乏的一类化合物,它所包含的种类相当多,一般分为水溶性维生素和脂溶性维生素。水溶性维生素大多是以离子形态存在于溶液中,可以采用CZE法进行分离分析,如果遇到混合样品中含有电中性的维生素试样时,则必需选用MEKC分离方法,如烟酸以及它的代谢物具有较强的亲水性,尽管这一类化合物中有个别代谢物在水溶液中以中性分子存在,但它们在水中良好的溶解度可以应用MEKC达到分离的目的9。解热镇痛药、抗组胺药、消炎药和止咳药 这些药物常用于治疗感冒头痛。这些化合物大部分在溶液中是电中性或不溶于水,比较适合采用MEKC法,早在90年代初寺部等10
12、对12种感冒药成分的分离进行了研究,发现5种不同的直链烷基阴离子表面活性剂的极性功能团对分离的选择性有很大的影响。市售的解热镇痛药片中的无水咖啡因、扑热息痛等用MEKC进行分离与定量,回收率接近100%,相对标准偏差低于2%11。有关这一方面的应用报道,近几年来逐渐增加,特别是添加有机溶剂、环糊精或混合表面活性剂使MEKC法所能适用的样品范围得到扩大。降压药 以普萘洛尔为代表的降压药物,分子内含有苯乙醇胺骨架,大多数的化合物呈碱性(pH 10左右),所以用阳离子表面活性剂MEKC法分离这一类化合物相当适用。如用MEKC法分离测定了尿样中10种2阻滞剂的含量11 以及血清样品中9种2阻滞剂的浓度
13、12,尿样测定结果的相对标准偏差在7%以内,但对血清测定结果的相对标准偏差则偏高,大部分在10%左右,最高达15.8%,这也表明对于成分越复杂的样品,测定结果的误差可能性越大,在这一点上,CE与其它方法是相同的。抗生素、合成抗菌剂 抗生素、合成抗菌剂大多以离子形态存在于溶液中,适用于CZE法。如用0.15mol/L硼酸作为电泳液(pH9.4)对硫酸庆大霉素进行分离与定量12,针剂中的3种有效成分的移动时间的相对标准偏差为5%,定量结果的相对标准偏差为2.1%3.6%,与微生物定量法的结果一致。另外,头孢拉定(cephradine)以及所含的主要杂质头孢氨苄(cephalexin)的分析,采用M
14、EKC法可以得到良好的分离13,比较了9批头孢拉定冲剂的HPLC和MEKC分析结果,两组的数据非常相近,测定结果的相对差值在-1.66%0.22%之间。3. 2 滥用药物 将HPCE用于滥用药物分析, 在毒品检验、戒毒工作方面有独特的优势。有些吸毒者虽然在短期内停止吸毒,在尿样或血清中检测不出毒品,但对于它们头发中痕量14可卡因、吗啡仍可用CZE检测出,以确定其有无吸毒史。3.3 药代动力学研究 李朵璐等15对左氧氟沙星(LVFX)和多索茶碱(Dox)合用在大鼠体内的药代动力学进行研究。用胶束电动毛细管电泳法(MECC)检测Dox的血药浓度。测定了单用和合用Dox的药代动力学参数，结果表明单用
15、和合用Dox均符合二房室模型。余丽宁等16建立了快速、准确测定大鼠血浆中马来酸曲美布汀浓度的HPCE方法，并用于其在大鼠体内的药物动力学研究。以盐酸麻黄碱为内标。003molL磷酸二氢钠(pH一60)为运行缓冲溶液，紫外检测波长为214 nm。3.4 对手性分子对映体药物的分离 据估计,常用的200多种药物中,一半以上至少具有1个手性中心,而这些药物中的75 %90 %是以外消旋体形式在市场销售,为了准确了解这些药的药效和安全性,有必要对手性药物的各个异构体进行分离并分别考察各自的生理活性;另外需要注意的是一些非手性药物,如抗精神病药物氟哌啶醇和抗癫痫药物苯妥因等,因为它们的体内代谢物都是手性
16、的,因此也存在立体选择性代谢问题。对手性药物的各个异构体进行分离,能更好地了解药效和安全用药,制定合理的给药方案,为剂量调整提供科学依据。手性分子对映体药物拆分技术是在背景电解质中加入有明显立体选择性的手性试剂(如环糊精、冠醚等) 使之与对映体形成络合物而被分离。刘会臣等18用高效毛细管电泳测定血清中盐酸反式曲马多对映体, 以0.8mmol/L -磺丁基-CD 作手性选择剂,在pH2.5的40 mmolL-1 Tris缓冲液中,分离了盐酸曲马多的4种立体异构体。4 毛细管电泳新技术及其在体内药物分析中的应用4.1 在柱预浓缩技术 近年来在CE应用中出现了各种在柱预浓缩(online preconcentration)技术，如场放大、样品堆积、等速电泳、色谱预浓缩等。4.1.1 场放大 将样品
