1800株G-杆菌插入序列共同区和整合子的耐药机制研究

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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 1 8 0 0 株G 杆菌插入序列共同区和整合子的耐药机制研究 R e s e a r c ho fr e s i s t a n c em e c h a n i s mo fI S C Ra n d i n t e g r o ni n 18 0 0G r a m n e g a t i v eb a c t e r i a s 专 业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 论文评阅人 临床检验诊断学 王凤平 芮勇字副研究员 吴晓蔓教授 李林教授 李娟教授 蔡应木教授 郑磊副教授 陈清教授 廖伟娇教授 黎永新教授 2 0 1

2、0 年5 月2 0 日广州 项士学位论文 18 0 0 株G 杆菌插入序列共同区和整合子的 耐药机制研究 硕士研究生 王凤平 指导老师 芮勇宇副研究员 摘要 研究背景与目的 随着抗生素的应用越来越广泛 细菌的耐药性就越来越严重 我国是世界 上滥用抗生素最为严重的地区之一 细菌的耐药性问题已经引起人们的高度关 注 我国目前临床上分离的细菌对常规抗生素的耐药率逐年上升 而且细菌在 异常的抗生素选择压力下 产生多重耐药的情况不断出现 因此研究细菌耐药 机制是十分必要和紧迫的 细菌耐药的生化机制非常复杂 通常是细菌对药物作用靶位 渗透性的改 变 产生灭活酶和钝化酶 排外系统的作用以及生物膜的产生等方面

3、 而从分 子生物学角度认识细菌的耐药机制 主要集中于基因突变和耐药基因水平传播 基因转移是细菌耐药性迅速扩散的主要原因 携带耐药基因的基因转移元件有 质粒 转座子 整合型噬菌体和整合子 以及最近几年才发现的插入序列共同 区 I S 傩 耐药基因可以通过接合 转化 转导和转座等方法在细菌间转移 通过转座的方式 整合子 I S C R 和转座子可以导致多个耐药基因在单个质粒中 聚集成束 这是多重耐药株产生的重要原因 I S C R 扫 i n s e r t i o ns e q u e n c e s I S s 和 c o m m o nr e g i o n s C R s 得来 它既具 有

4、插入序列 I S s 的特点 也具有共同区 C R s 的特点 插入序列属于高度可移动 性转座因子 是对基因组一个或多个靶位点具有插入能力的小分子D N A 片段 并常可以移动邻近的基因 共同区域 C 风 是1 9 9 3 年在复杂性I 类整合子I n 6a n d 中文摘要 I n 7 中作为一个长约2 1 5 4 b p 的D N A 片段而首先发现的 C R s 是一类I S 9 1 1 i k e 因子家 族的延伸成员 它具有与相似位置I S 9 1 1 i k e 因子的两个主要特点 缺少末端反向重 复序列和它们转移邻近耐药基因是通过滚环复制的形式进行的 另外 C R 序列 还保留着

5、I S 9 1 的第三个特点 复制终止子序Y l J t e r l S 相应地 为了强调它们作为 插入序列的同源性和它们被发现的历史 研究假设它们是特定的I S C R 因子 用来 区分C R s 的数字被保留下来以便区分不同的I S C R s 因此 C R l 对应I S C R l C R 2 对 应I S C R 2 等 I S C R s 包含1 个O R F 序列 o r f S l 3 o r f 5 1 3 基因编码5 1 3 个氨基酸序列产物 其功能与转座酶相似 可以转移基因盒 在复杂性I 类整合子中 o r f 5 1 3 下游可 以有由一种或以上的耐药基因组成的基因盒

6、紧接着是q a c s u l 的3 C S I S C R 常见的可以分为6 类 目前研究较多的为l 2 3 4 类 研究发现这几种类型 的I S C R 均与耐药基因的传播相关 其中 最为重要的是I S C R l 它经常出现在 复杂性I 类整合子的基因序列中 I S C R l 介导一系列的转座事件发生 转座不同 长度的耐药基因盒 如c a t A 2 a f r A q n r 和各种b l a c M y 基因 I S C R l 对耐药基因 的传播发挥重要的作用 另一个重要的基因转移元件是整合子 整合子是细菌的D N A 片段 它的独特 结构可捕获并整合外源性基因 并使之转变为功能

7、性基因的表达单位 其整合的 基因盒大多与耐药基因有关 对细菌基因组进化和耐药性具有重要意义 根据整 合酶不同进行分类 整合子主要分为I 类 其中 I 类整合子最常见也是最早 被发现的整合子 其基因盒的移动已得到证实 I 类整合子在革兰阴性杆菌中通过 可变区整合一个或多个耐药基因盒介导宿主菌多重耐药 在临床检测中具有重 要的意义 这类整合子5 保守区有编码I 型整合酶的基因i n t l l 重组位点a t t l l 和启动子P a n t 3 保守区由3 个开放阅读框组成 q a c E A I s u l I 和O R F 5 有的 整合子没有3 保守区 I 类整合子在革兰阴性菌中广泛分布

8、 检出率最高 在许 多临床分离的菌株包括肠杆菌科中的埃希菌属 克雷伯菌属和非发酵革兰阴性 杆菌中的假单胞菌属和不动杆菌属等都能检出 I 类整合子可以携带多种耐药基 因 如B 内酰胺类 氨基糖苷类 甲氧苄啶 氯霉素 链霉素 喹诺酮和季铵 硕士学位论文 类化合物等耐药基因 对耐药基因在革兰阴性杆菌中的传播十分重要 I S C 足J 经常出现在复杂性I 类整合子的基因序列中 I S C R J 上游序列通常是相 同的 而在I S C R l 与I 类整合子3 保守区的连接点序列是不变的 这些都表明 I S C 足J 很符合复杂性I 类整合子的特征 无论是I S C R l 连同耐药基因插入到普通的

9、一类整合子组成的复杂性整合子 还是带有两个拷贝I S C R I 因子的复杂性整合 子 它们都带有许多耐药性因子 具有广泛传播这些耐药基因的潜能 复杂性I 类整合子所携带的多重耐药基因是临床研究多重耐药所不可忽视的 这一结构 为研究多重耐药的机制提供了更多的途径和方向 中国是一个抗生素滥用比较严重的国家 细菌的耐药情况也比其他国家或地 区严重 细菌所携带的耐药基因种类也相对较多 从科学研究方面看 这是一 个丰富的资源 如果对大量耐药菌株进行研究 肯定能发现很多新的耐药相关 信息 有利于临床治疗细菌的感染 一I S C R l 和I 类整合子都是细菌携带耐药基因常见的重要基因元件 与耐药基因 的

10、水平转移密切相关 国外已经有在多种菌种中的I S C R l 的研究报道 但是中国 国内还没有相关的报道 而I 类整合子的研究虽然已经很多 但是在中国还没有 研究是同时对大量不同菌种细菌同时进行的 这是本研究的突破点和创新点 因此 本课题针对常见革兰阴性杆菌进行I S C R l 和I 类整合子耐药基因的 筛查 测序 得到新的耐药基因组合 从而了解I S C R l 和I 类整合子的耐药机 制 以及初步了解这两者的串联关系 研究方法 1 菌株的挑选及基因组D N A 的提取大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是从2 0 0 5 年 到2 0 0 9 年的菌株 分别在各年中挑选不重复的多重耐药菌株 而其他细

11、菌 阴 沟肠杆菌 产气肠杆菌 普通变形杆菌 奇异变形杆菌 粘质沙雷菌 居泉沙 雷菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 嗜麦芽窄食单胞茵 洋葱伯克霍尔德氏 菌 恶臭假单胞菌等 是从2 0 0 8 年到2 0 0 9 年两年内在l 临床中收集的不重复的 多重耐药菌株 共收集到1 8 0 0 株细菌 用S D S 蛋白酶K 酚 氯仿方法抽提这些 l 中文摘要 菌株的基因组D N A 2 I S C R l 中o r f 5 1 3 基因和可变区耐药基因的检测引用国外已经应用的o r f S l 3 基 因相关引物对所提取的基因组D N A 进行扩增 再用I S C R l 可变区引物对o r f S l

12、3 基 因阳性株进行P C R 的筛查 然后酶切可变区基因并进行初步分类 挑选各种类型 测序 分析同源性和耐药基因组合 G e n e B a n k 上申请序列号 3 I 类整合子中I 类整合酶基因和可变区耐药基因的检测引用国内外已经应用 的相关I 类整合酶基因引物进行I 类整合酶的筛查 得到阳性株后再用国外研究中 的引物进行整合子可变区基因的检测 然后酶切可变区基因并进行初步分类 挑选各种类型测序 分析同源性和耐药基因组合 G e n e B a n k 上申请序列号 4 初步了解I S C R I 与I 类整合子之问的串联关系实验设想在既含有I 类整合子 基因又含有I S C R l 基

13、因的菌株中 这两者是串联存在的 构成复杂性I 类整合子 实验中用本研究设计的引物对I 类整合子靠近3 保守区的基因和I S C R l 的靠近5 保守区的基因间的序列进行P C R 的检测并测序分析 研究结果 1 检测得到本实验菌株中I S C R l 携带的主要耐药基因 并发现了在不同菌种中 I S C R l 携带的新耐药基因组合总结所有实验菌株 发现I S C R l 主要携带喹诺 酮 q n r A l q n r B 2 和q n r B 6 p 一内酰胺类 b l a p g R a m p C a m p R 和b l a c r x M 9 和季铵类化合物 q a c E d

14、等耐药基因 同时发现了1 0 个耐药基因组合是I S C R l 于相应的菌种在国内外首次报道的 在大肠埃希菌中 o r f 5 1 3 s a p A l i k e q n r B 2 q a c E d e l t a l 和o r f 5 1 3 s h o r t c h a i n d e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e q n r B 6 q a c E d e l t a l 阴沟肠杆菌D 垆1 3 s h o r tc h a i nd e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e q n

15、r B 6 q a c E d e l t a l 和o r f 5 1 3 b l a c r x M 9 i n s B q a c E d e l t a l 产气肠杆菌 D 矿1 3 a m p C a m p R q a c E d e l t a l 居泉沙雷菌o r f 5 1 3 s h o r tc h a i nd e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e q n r B 6 q a c E d e l t a l 鲍曼不动杆菌o r f 5 1 3 q n r A l a m p R q a c E d e l t a l 和 o

16、 r f 5 1 3 b l a e e R t G S T l i k ep s e u d o g e n e q a c E d e l t a l 在铜绿假单胞菌 o r f i l 3 q n r A l a m p R q a c E d e l t a l 嗜麦芽窄食 单 胞 菌 I V 硕士学位论文 D 筘1 3 q n r A I a m p R q a c E d e l t a l 另外还有2 个组合是国内首次报道的 在肺炎 克雷伯菌中o r f 5 1 3 s a p A l i k e q n r B 2 q a c E d e l t a l 和阴沟肠杆菌 o r f 5 1 3 q n r A l a m p R q a c E d e l t a l 2 检测得到I 类整合子携带的主要耐药基因 并发现了不同菌种中I 类整合子 携带的新耐药基因组合本实验中检测到I 类整合子携带的耐药基因主要有氨 基糖苷类 a d d A l a a d A 2 a a d A 5 a a d A l 3 a a d B a a c 6 以a a c A 4 a a c C