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1、基因克隆实验手册 目录 cDNA合成 核酸纯化 琼脂糖凝胶电泳 基本的连接反应 定向克隆 限制性内切酶 连接反应 TA克隆 In Fusion克隆 基因克隆实验 操作流程 基因克隆实验手册 1 基因克隆实验指南 基因克隆操作的基本流程 T载体 T T 3 A A 3 5 GATC TCGA 5 线性化载体 C T A G A G C T 5 In Fusion HD Enzyme Premix In Fusion酶使 末端15个相同 碱基无缝融合 total RNA mRNA 基因组DNA等 反转录反应 cDNA合成 目的DNA片段 使用In Fusion引物获得的 PCR扩增产物 目的DNA
2、片段 扩增产物末端附加 有 dA 目的DNA片段 带有限制性内切酶的 酶切末端 PCR 限制性内切酶处理 DNA修饰 附加接头 末端平滑化 定向等 琼脂糖凝胶电泳确认 转化 感受态细胞 形成菌落 进行菌落PCR 确认插入片段 EmeraldAmp MAX PCR Master Mix等 电泳相关制品 培养纯化质粒DNA TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4 0等 目的DNA的解析 测序 蛋白表达 基因导入 重组病毒制作 Translation等 PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后 切胶 回
3、收 或必要时进行去磷酸化反应 将目的DNA片段 靶序列 插入到任意载体中的基因克隆操作是基因工程实验的基本技术之一 目前也广泛应用于各种研 究领域中 限制性内切酶的发现和应用使基因克隆成为一种广泛性的实验手法 但近年来无需使用限制性内切酶处理的TA克隆法及 In Fusion法的开发可随心所欲的进行基因克隆 另外 基因克隆时 从检测样品中提取和纯化基因组DNA及RNA mRNA的反转录反应合成cDNA PCR反应扩增DNA片 段等也是获得目的DNA的非常重要的操作环节 本实验手册对使用限制性内切酶的传统克隆法 广泛使用的TA克隆法及最新克隆法In Fusion克隆进行基因克隆时所必需 的各种实
4、验操作 DNA纯化 cDNA合成 菌落PCR等 的操作方法概要进行介绍 克隆实验手册 中所记载的内容对基因克隆初学者和具有一定经验的研究人员会有所帮助 希望大家随时使用 cDNA文库DNA片段 In Fusion克隆TA克隆限制性内切酶 连接 in vitro Hind BamH 2 克隆方法插入DNA片段的末端形状载体制备 限制性内切酶 连接 TA克隆 In Fusion克隆 根据使用目的推荐的克隆用试剂盒 制备插入DNA片段和载体 实验目的推荐使用的试剂盒 快速 高效率地连接DNA Ligation Kit In Fusion HD Cloning Kit Blunting Kinatio
5、n Ligation BKL Kit Mighty TA cloning Kit Mighty TA cloning Reagent Set for PrimeSTAR TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 想快速 高效地进行基因克隆 产品信息 P4 P6 P6 P6 P8 P4 无缝融合相同序列后 可简单的进 行目的基因的PCR片段的克隆 想进行连接反应 想进行TA克隆 T T T载体 3 A 插入片段 A 3 插入片段 线性化 载体 线性化载体 可在任意载体的任何位点插入 DNA片段 不附加任何多余序列 In Fusion反应仅需15分钟 克隆效率高 可插入几个DNA片
6、段及长链DNA 片段 需要在DNA片段的两端形成限制性内切酶识位点 利用不同的限制性内切酶的酶切位点可决定插入 DNA片段的插入方向 根据DNA片段的两末端进行相应的 限制性内切酶处理 酶切后必要时 进行纯化及去磷酸化处理 可使用任意载体 仅需限制性内切 酶处理或PCR扩增使载体线性化 利用市面上销售的3 末端附加有 dT的载体 使用3 端附加 dA 的PCR酶进行PCR反应 或 需要在平滑末端的扩增产物中进行 dA 加尾反 应 不能决定插入片段的插入方向 利用在引物末端附加与载体末端相同的15个碱基 序列进行目的基因的扩增 平滑末端的连接 插入片段的3 端附加有 dA 碱基 插入片段为平滑末
7、端需要附加 dA碱基 大片段插入片段 10 kb 的连接 插入片段 想一次克隆多个DNA片段 想进行定性克隆 想在没有酶切位点的位置插入DNA片段 因为是表达载体 不想附加多余碱基序列 基因克隆实验手册 BamH Hind 利用限制性内切酶 连接进行基因克隆 将目的DNA片段插入到目的载体质粒的基因克隆操作是基因工程实验的基本操作方法 这里对使用限制性内切酶和T4 DNA连接酶 DNA Ligation Kit 的基因克隆操作进行说明 操作方法概要 1 准备插入DNA片段 制备目的DNA片段 a 使用限制性内切酶切割DNA片段 b PCR反应扩增DNA片段 例 使用限制性内切酶 d 和 H 进
8、行双酶切 配制反应液 37 反应1小时 取一半反应液 10 l左右 加入Loading Buffer后进行琼脂糖凝胶 电泳 确认酶切反应 切胶回收目的DNA片段 为避免DNA的损伤 减少UV照射时间 使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver 4 0等 进行PCR扩增产物的纯化 参考第10页 使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4 0 纯化切胶回收的DNA 切胶回收DNA的操作方法请参考第10页 回收液作为插入DNA片段溶液 A 37 反应1小时 使用TaKaRa
9、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4 0等 纯化回收 参考第10页 回收液作为插入DNA片段溶液 A 使用Takara Cut Site Navigator 下一页 非常方便 底物DNA 1 g 1 l 1 l 10 K Buffer 2 l 灭菌水 up to 20 l 轻弹混合 去磷酸化处理 防止自连 37 65 反应30分钟 苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 提取 2次 氯仿 异戊醇 24 1 提取 1次 乙醇沉淀 溶解于TE Buffer 20 l以下 作为质粒DNA溶液 B 限制性内切酶处理后的载体1 20 pmol Alkal
10、ine Phosphatase BAP 0 3 0 6 U 10 Alkaline Phosphatase Buffer 5 l 灭菌水 up to 50 l 2 准备载体质粒 使用限制性内切酶在目的载体质粒 环状 的克隆位点进行酶切反应 载体的线性化 37 反应1小时 使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver 4 0等 纯化反应液 参考第10页 回收液作为质粒DNA溶液 B Tks Gflex DNA Polymerase使用例 PCR PCR扩增产物的纯化 限制性内切酶酶切位点 5 端3个以上碱基 2 Gflex PCR Buf
11、fer Mg2 dNTP plus 25 l Forward Primer 0 2 0 3 M final conc Reverse Primer 0 2 0 3 M final conc 模板DNA 500 ng Tks Gflex DNA Polymerase1 25 U 灭菌水 up to 50 l 94 1 min 98 10 sec 60 15 sec 68 30 sec kb 利用限制性内切酶酶切反应对PCR扩增产物的两端进行酶切处理 必要时可增加反应体积 30 cycles 首先确认目的DNA片段的限制性内切酶的酶切位点 然后根据载体 质粒的克隆位点选择限制性内切酶 利用与载体连
12、接的限制性内切酶酶切位点的5 端附加 的引物进行 插入DNA片段的PCR扩增 轻弹混合 上述纯化后的PCR产物 2 l 1 l 1 l 10 K Buffer 2 l 灭菌水 up to 20 l 轻弹混合 载体质粒DNA 1 g 1 l 1 l 10 K Buffer 2 l 灭菌水 up to 20 l 轻弹混合 轻弹混合 使用一种限制性内切酶制备插入DNA片段和载体质粒的 线性化时 为避免载体的自连应进行下面的载体的去磷 酸化处理 5 端突出末端的去磷酸化处理使用CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase 即可 平滑末端及3 端突出末端的去磷酸化处
13、理 建议使用BAP Bacterial Alkaline Phosphatase 基因克隆实验手册 3 HinBam Hind BamH Hind BamH Hind BamH 4 基因克隆实验手册 3 插入DNA片段与线性化质粒的连接 使用DNA Ligation Kit Mighty Mix 时 使用 HST08 Premium Competent Cells时 16 反应30分钟 或25 反应5分钟 使用前在冰上将100 l HST08感受态细胞融化后轻轻混合 移至 14 ml圆底Tube中 不可振荡混合 加入10 l连接反应后的反应液 在冰中放置30分钟 42 反应45秒后 在冰中放置
14、1 2分钟 加入已预先37 保温的SOC培养基 使终体积为1 ml 37 振荡培养1小时 160 225 rpm 取适量涂布于LB选择培养基 37 过夜静置培养 插入DNA片段溶液 质粒DNA溶液 B A 50 ng 25 fmol 25 250 fmol Ligation Mix 7 5 l 灭菌水 up to 15 l 4 转化 5 PCR扩增确认插入片段DNA 6 培养 纯化质粒 PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页 TaKaRa Bio网站上的限制性内切酶识别序列检索工具 只要输入DNA碱基序列 即可显示切断位点及模式图和详细的碱基序列 关联产品 Q1 难以连接 转化效率低时的注意
15、点有哪些 A1 Q2 长链DNA克隆时的注意点有哪些 A2 常见问题 产品名 Alkaline Phosphatase C75 H I Alkaline Phosphatase Calf intestine Tks Gflex DNA Polymerase TaKaRa DNA Ligation Kit LONG DNA Ligation Kit Ver 2 1 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver 4 0 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4 0 TaKaRa M
16、iniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4 0 Agarose Regular d III digest DNA Ligation Kit 100 bp DNA Ladder Dye Plus 包装量 10 000 U 10 000 U 50 U 1 000 U 250 U 1 Kit 1 Kit 1Kit 100 次 1 Set 100 l 10 1 Set 100 l 10 50 次量 50 次量 50 次量 50 g 100 次量 100 g 限制性内切酶 去磷酸化处理 PCR 连接 转化 纯化DNA Code No 1060A 1010A 2120A 2250A R060A 6023 6022 6024 9128 9052 9761 9762 9760 5260 3422A 390 530 260 420 2 000 500 500 630 400 300 350 350 350 300 360 价格 元 Takara Cut Site Navigator 请延长连接反应时间 DNA溶液的盐浓度偏高会导致连接效率下降 特别是乙醇沉淀时使用的醋酸
