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1、1计算机辅助 CDK6 抑制剂先导化合物初步设计及化合物活性的测定作者：马国光，郭坤元，尚振川 【关键词】 计算机辅助药物设计Computerassisted primary design of lead compounds of CDK6 inhibitors and determination of their bioactivity【Abstract】 AIM: To primarily design the lead compounds of CDK16 inhibitors based on CDK6 structure and to test their bioactivity.
2、METHODS: Using LigBuilderv1.2 a kind of computerassisted drug design (CADD) program, we tried to design new lead compunds of CDK6 inhibitors by method of de novo design and according to Lipinski rule, and test their IC50 by MTT assay. RESULTS: We got the structures of 50 new chemical compounds as th
3、e lead compounds for further drug filtering, and 3 of 8 compunds we synthesized successfully had a bioactivity between 220 and 310 mol/L. CONCLUSION: The new compunds have some inhibitory activity and the efficiency of finding lead compounds can be 2improved with the help of CADD.【Keywords】 CADD; CD
4、K6 inhibitor; IC50【摘要】 目的： 初步设计 CDK6 抑制剂先导化合物，并测定化合物活性. 方法：利用计算机辅助药物设计（ CADD）程序LigBuilderv1.2，依据 Lipinski 法则，采用从头设计、片断生长的方法，在 Linux 操作系统下，设计全新 CDK6 抑制剂化合物；MTT法测定化合物 IC50. 结果：得到 50 种化合物结构并成功合成 8 种，经测定其中 3 种有活性（ IC50 在 220310 mol/L间）. 结论：新型 CDK6 抑制剂化合物具有一定抑制活性，CADD 可以大大提高先导化合物发现的效率，加快新药研究的步代.【关键词】 计算机
5、辅助药物设计; CDK6 抑制剂; IC500 引言根据肿瘤干细胞理论1-3 ，干细胞相关基因及其编码蛋白是对于肿瘤的发生、维持具有重要意义. 近年来的研究表明2-4 ，BMI1 信号通路不仅对于维持干细胞的生物特性具有重要意义，而且在肿瘤发生过程中也扮演重要的角色. 本研究试图从 BMI1 信号通路的重要组分，细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK6）入手，利用3计算机辅助进行药物设计，以期找到可以对该信号通路进行干预的良好的先导化合物，为进一步药物筛选打下良好的基础.1 材料和方法1.1CADD（计算机辅助药物设计）获得 CDK6 活性位点： 建立参数文件 cdk6pocket. index，进
6、入 LibBuilder 程序 pocket子程序，运行 pocket,得到 CDK6 的活性位点信息. 用 C 自行设计程序取得 CDK6 活性口袋的坐标信息，并查找配体 p16ink4d 位于活性口袋的原子坐标信息. 选取其中的原子 N， CA， C，0 结构信息作为种子结构,用 Hyperchem 正确加氢后存储为 mo12 文件.获得配体： 根据 Lipinski 法则编辑参数文件 cdk6grow. index,进入 LigBuilder 子程序 grow,运行 grow，选取 50 个生成结构，在 Linux Red Hat9.0 操作系统下，CPU 为 AMD Athlon180
7、0+的 PC 上运行时间为 1.5 h. 编辑 process 参数文件，运行 process，得到结果文件.1.2 细胞株的培养急性白血病细胞系 K562（本室保存）细胞在含 100 mL/L 热灭活小牛血清的 RPMI 1640 培养液中常规培养传代（37, 50 mL/L CO2）. 10 种化合物分别溶于三蒸水中，配成510-3 mol/L 储存液储存在-20，对照组培养中仅含相应量的4DMSO（0.1% ）.1.3 细胞毒试验采用常规 MTT 法测定药物体外抗肿瘤活性,简言之, 取对数生长期细胞, 用含有 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640培养液配成 1108/L，接种
8、于 96 孔微培养板（细胞数为 1105， 180 L/孔） ，37， 50 mL/L CO2 条件下培养过夜 . 将化合物对倍稀释成 6 个浓度，每孔加药液 20 L，以 STI571 为阳性对照，阴性对照加等体积生理盐水，使终体积为 200 L/孔. 药物作用 72 h后，每孔加 MTT 20 L（5 g/L）,37继续培养 4 h,离心(1000 r/min, 10 min)弃上清 ,每孔加入 DMSO 150 L,振荡至沉淀完全溶解；在酶标仪上检测 432 nm 处光密度 A 值. 细胞生长抑制率按以下公式计算：抑制率（%）=（对照组 A 值-加药组 A 值）/ 对照组A 值100%，
9、以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，根据回归方程求出该药物的半数抑制浓度(IC50)，即细胞存活率减少一半时的药物剂量.2 结果生成 50 个候选化合物，除去对受体配体结合不利的原子共有 5 种骨架结构，合成得到 8 种结构进行生物活性测定，化合物（图 1）对 K562 肿瘤细胞生长抑制实验结果表明，8 个化合物中有3 个具有抑制活性，IC50 介于 220310 mol/L之间（表 1）. 化5合物主要和 CDK6 活性口袋中的 LEU166， ARG168 上的疏水集团，ARG168， GLN149 上的氢键供体氨基形成稳定结合（图 24）.图 1CDK6 抑制
10、化合物母核结构式（略）表 1CDK6 抑制剂对 K562 细胞系的抑制作用3 讨论BMI1 是维持干细胞生物学特性的重要蛋白,近年来研究发现该蛋白同样对于肿瘤的维持具有重要作用. BMI1 发挥作用的途径称为 BMI1 信号通路，该通路有两个分支： 一条分支是通过抑制p19arf，最终抑制 p53 发挥作用. 该通路中有一个重要蛋白MDM2，由于该蛋白可以抑制 p53 蛋白发挥抗癌作用，利用CADD 方法设计了 MDM2 小分子抑制剂，成功地在人类肿瘤长期移植的裸鼠身上抑制了肿瘤的生长；在该通路的一个分支中，BMI1通过抑制 p16ink4a 发挥作用5. P16ink4a 也是一种肿瘤抑制蛋
11、白，它可以抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK6）和细胞周期素D(cyclin D)的结合，该蛋白受抑制时，CDK6 可以和 cyclin D 结合激活，从而进一步磷酸化视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白（pRB）使E2F 依赖性的转录过程发生，细胞内 DNA 合成，进入周期循环. 干细胞（肿瘤细胞）依赖此机制不停地进行细胞循环和 DNA 合成以维持自身. 根据这一特性，如果能设计一种可以和 CDK6 稳定结合6的抑制剂发挥类似 p16ink4a 的作用，将对肿瘤产生稳定的抑制作用，本研究得到的 50 种化合物均可以和靶蛋白稳定结合（pkd8.10）.图 2 化合物 1 C24H2803 和 CDK6
12、 相互作用图 pkd=8.1（略）图 3 化合物 2 C28H3803 和 CDK6 相互作用图 pkd=9.2（略）由于软件接受的受体蛋白信息是基于 p16ink4a/CDK6 的复合物，所以得到的与 CDK6 相结合的活性位点是和 p16ink4a 对应的. CADD 已成为药物设计中的常规方法之一，利用 CADD，新药开发的周期可以大大缩短，经费开支大大减少. 利用 CADD 已成功设计了多种新药，如陈凯先等6用 CoMRA 方法对喹诺酮类抗菌药物的定量构效关系（QSAR）的研究发现了 3 种生物活性强于氧氟沙星的新化合物；Gschwend 等7用分子对接方法设计的二氢叶酸还原酶（DHF
13、R）抑制剂. 本研究采用从头设计法（ de novo design）不依赖于已知三维结构的先导化合物，得出的分子是全新的化合物，但同时也可能出现化合物合成困难的问题. 本研究得到的 50 种化合物只有 8 种可以合成.7图 4 化合物 3 C25H3202 和 CDK6 相互作用图 pkd=8.6（略）LigBuilder 是北京大学来鲁华教授课题组开发的基于分子结构的 CADD 程序8-9 ，可运行于除 Windows 外的多数计算机操作系统，包括 Unix, Linux 等. 利用该软件可采用从头设计的方法设计先导化合物，该软件结合了国外从头设计软件 LUDI 和 grid 的优点，使利用
14、一种软件就可以完成包括种子结构的设计，片段生长（grow） ，片段连接（link）在内的各种工作成为可能 . 该程序包还为使用者提供了极大的灵活性，如种子结构的生成就需要使用者灵活运用各种手段以得到合适的种子结构，而种子结构的选择对于化合物生成具有决定性的意义，一般是从配体位于靶蛋白的活性口袋内的原子中选取. 本研究自行设计了寻找种子结构的程序，但不提供优化功能. LigBuilder 程序采用遗传算法最终得到的先导化合物是成千上万符合筛选条件的化合物中的佼佼者，因此可以最大程度地满足使用者的要求.本研究利用 CADD 方法成功设计了 CDK6 抑制剂的先导化合物，并初步证明部分化合物具有一定
15、的生物活性，以后的研究拟对先导化合物结构做进一步优化，期望最终得到具有良好抑制活性的CDK6 抑制剂.8【参考文献】1 Kopper L, Hajdu M. Tumor stem cells J. Pathol Oncol Res, 2004,10:69-73.2 Max J. Mutant stem cells may seed cancer J . Science, 2003,301:1308-1310.3 Muhammad AH, Michael WB, Max W. Therapeutic implications of cancer stem cells J. Curr Opin G
16、enet Dev, 2004,14:43-47.4 Park IK, Morrison SJ, Clarke MF. Bmil, stem cells, and senescence regulation J . J Clin Invest, 2004,113(2):175-179.5 Vassilev LT, Vu BT, Graves B, et al. In vivo activation of the p53 pathway by smallmolecule antagonists of MDM2 J. Science, 2004,303(5659):844-848.6 陈凯先 ,蒋华良,嵇汝运. 计算机辅助药物设计原理、方法及应用M. 上海： 上海科学技术出版社，2000：12-13.97 Gschwend DA, Sirawaraporn W, Santi DV
