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1、1血管生成素 1 和报告基因 EGFP 双基因共表达腺病毒的构建作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉 【摘要 】 目的：构建并制备血管生成素1 和 EGFP 双基因共表达重组腺病毒载体. 方法：采用基因克隆技术克隆目的基因ANG1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因 EGFP 的穿梭载体pAdTrackCMV；使用 Padeasy1 腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌 BJ5183 中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入 QBI293A 细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果：ANG1 基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经 Xho I/
2、EcoR V 双酶切后琼脂糖电泳可见在 1.5 kb 处出现特异性条带，证明 pAdTrackCMVANG1 重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与 pAdeasy1 质粒重组后，产物经 Pac I 酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为 30 kb 和 4.5 kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒 pAdANG1EGFP 构建成功；线性化重组的腺病毒转染入 QBI293A 细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为 21014 v.g./L，EGFP 活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论：成功制备了 pAdANG1EGFP 腺病毒. 为骨组织工程血管化的研究打下基础. 2【关键词】
3、 血管生成素； 腺病毒； 基因转染； 增强型绿色荧光蛋白0 引言大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因. 因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要. 血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而 ANG1 在这一过程中起着重要的调节作用1-2. 所以对于 ANG1 的研究对于大段骨缺损的治疗显得极有意义. 本研究中， 我们设计、 构建了携带ANG1 基因的腺病毒（adenovirus） ， 为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.1 材料和方法1.1 材料 pcDNA3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒pAdT
4、rackCMV(含 EGFP 基因)、pAdeasy1, 菌种 BJ5183 购自Stratagene 公司；293A 细胞株、转染试剂 (lipofectamine 2000)购自 Invitrogen 公司. 各种限制性内切酶，T4 连接酶、反转录酶PrimeScriptTM Reverse Transcriptase, DNA 聚合酶3（PrimeSTARTM HS DNA polymerase）, PMD18T vector 购自 Takara 公司. 质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（OMEGA BIOTEK）公司,mRNA 提取试剂（PolyAtract system
5、1000）,MMLV 购自 Promega 公司.1.2 方法1.2.1 血管生成素1 （ANG1 ）基因的克隆及鉴定在Genebank 上查询 ANG1 的序列为 NM_001146. 根据此序列设计引物. 引物序列为：F: CCGCTCGAG ATGACAGTTTTCCTTTCC, R: TTTGATATCTCAAAAATCTAAAGGTCG 上游引物引入 Xho位点，下游引物引入 EcoR位点. RNA 的提取及 cDNA 的获得：使用 PolyAtract system 1000 试剂盒从胎盘组织中提取 mRNA 提取步骤按照说明书进行，将提取的 mRNA 使用反转录酶PrimeScr
6、iptTM Reverse Transcriptase 反转录为 cDNA，步骤按照说明书进行. PCR 扩增 ANG1 基因片段：以上述获得的cDNA 为模板，进行 PCR 反应. 反应条件为 98 10 s, 65 5 s, 72 2.5 min. 35 个循环. 琼脂糖电泳鉴定. ANG1 克隆入PMD18T vector，DNA 测序鉴定：将 PCR 产物进行凝胶回收纯化后，克隆至 PMD18T vector 中，将质粒 PMD18TANG1转化至细菌 DH5 中，扩增后送公司测序.41.2.2 携带 ANG1 基因和报告基因 EGFP 的腺病毒载体的构建将基因 ANG1 克隆至腺病毒
7、穿梭载体 pAdTrackCMV：质粒PMD18TANG1 和穿梭载体 pAdTrackCMV（含有基因EGFP）分别进行 Xho/EcoR双酶切，产物胶回收后，按 151比例混合，加入 T4 连接酶进行连接. 转化入细菌 DH5，提取克隆进行酶切鉴定. 病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒 pAdeasy1 转化入细菌 BJ5183 中，得到含有 pAdeasy1 的 BJ5183 细菌，将鉴定正确的携带目的基因 ANG1 的穿梭载体转化入含有pAdeasy1 的 BJ5183 中进行同源重组. 挑取其中较小的菌落扩增、提取质粒. 重组病毒的鉴定：将重组的质粒 Pac I 酶切后进行 8 g/L
8、琼脂糖电泳，与标准的重组腺病毒酶切谱形进行对比，鉴定得到的重组病毒是否正确.1.2.3 重组腺病毒的包装及扩增腺病毒的包装：培养 293A 细胞，6 孔板按每孔 4105 铺细胞，第 2 d 将重组的腺病毒质粒 Pac I 酶切线性化，并胶回收法纯化. 然后将线性化的质粒 DNA 使用脂质体 lipofectamine 2000 转染入 293A 细胞中. 第 4 d 换液，第11 d 收集细胞，反复冻融收集病毒 . 腺病毒的扩增：得到病毒的1/3 用于感染新的 293A 细胞，48 h 收集细胞. 如此反复共进行 4轮扩增，收集所有细胞，反复冻融，得到重组腺病毒.1.2.4 重组病毒物理滴度
9、测定采用点杂交法测定重组病毒的物理滴度（以载体基因组数量/L 表示，即 v.g./L）具体方法如参考文献55.1.2.5 重组病毒 EGFP 的活性检测培养 293A 细胞，按 5104/孔细胞接种于 24 孔细胞培养板中，常规培养 24 h. 按 MOI 梯度值（2105, 1105, 5104）确定重组病毒加样量. 阳性对照病毒由本元正阳基因基因技术有限公司提供(物理滴度为 11015 v.g./L),加样 MOI 值为 1105.2 结果2.1ANG1 基因的克隆及鉴定经过提取 mRNA、反转录、PCR扩增得到了大小约为 1.5 kb 的预期片段. 经酶切鉴定，及 DNA 测序分析证实
10、ANG1 基因克隆成功 .2.2 腺病毒载体的构建及鉴定基因 ANG1 成功克隆至腺病毒穿梭载体 pAdTrackCMV 中，穿梭载体 pAd TrackCMVANG1与骨架 DNA 在细菌 BJ5183 中成功重组出腺病毒pAdANG1EGFP. 重组的腺病毒质粒经 Pac I 酶切，8 g/L 琼脂糖电泳分析. 在图 2 中可见经 Pac I 酶切后出现一大一小 2 个片段，大片段约为 30 kb，小片段约为 4.5 kb. 与预期的谱形相同. 证实重组腺病毒成功.62.3 重组腺病毒的包装及扩增重组的腺病毒 DNA 经线性化后转染入 293A 细胞，在 293A 细胞中包装腺病毒 . 在
11、包装的第3，5 ，8 ， 11 d 分别用倒置荧光显微镜观察，发现荧光逐渐增多，光镜下观察细胞在 8 d 出现病理性变化（CPE）. 证实病毒包装成功. 将得到的病毒继续感染新的 293A 细胞，扩增病毒 . 经过 4 轮扩增，最终病毒的滴度达到 21014 v.g./L.2.4 重组腺病毒的 EGFP 活性检测重组腺病毒各 MOI 梯度的EGFP 活性不一（表 1，图 3）.表 1 重组病毒 EGFP 的活性检测结果3 讨论目前在血管化的研究中，促血管形成的细胞因子的研究正在成为热点. 相对于直接应用蛋白分子治疗，基因治疗有着价格低廉，作用持久的优势. 本研究设计使用重组腺病毒作为基因治疗的
12、手段. 相对于其他方式，重组腺病毒有着其本身独有的优势：毒感染效率高，可达到 90%以上；不整合如宿主细胞的 DNA，安全性较好；携带基因表达的时间约 48 wk，这与骨愈合的时间相符，因此是骨组织工程研究的理想的工具6.ANG1 基因在 1996 年由 Davis 首次克隆出来，具有抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞出芽、迁移和趋化等重要作用，在成骨细7胞有明显表达，在骨折愈合过程中发挥重要作用. 我们克隆了基因ANG1,并使用经典的 pAdeasy1 系统7构建并包装扩增带有ANG1 和 EGFP 的腺病毒. 在腺病毒的重组中，我们较之经典方法做了一些改进. 在经典的方法中，穿梭载体和骨架质粒
13、是使用磷酸钙法同时转入细菌 BJ5183 中进行同源重组的，而我们在本研究中采用分步转化的方法先将骨架基因转化入 BJ5183 中，然后再将携带目的基因的穿梭载体 pAdTrackCMVANG1 转化入含有病毒骨架基因的 BJ5183 中，完成同源重组. 经过改进后的方法同源重组正确的几率大大提高. 在我们的实际工作中，该方法重组后挑选最小的 10 个克隆，经 Pac I 酶切鉴定，有 8 个正确. 同源重组的正确率在 80%. 重组后的病毒 DNA 经 293A 细胞包装并扩增后滴度可达到 21014 v.g./L.病毒感染效率实验显示本研究制备的腺病毒有着较高的感染效率, 可用于血管化的相
14、关实验研究.【参考文献】 1 Hildbmnd P, Cinilli V, Prinsen EC, et al. The role of angiopoietins in the development of endothelial cells from cord blood CD34+ progenitorsJ . Blood,2004,104(7):2010-2019.82 Young MR. Tumor skewing of CD34+ progenitor cell differentiation into endothelial cellsJ. Int J Cancer,2004,1
15、09(4):516-524.3 Gluzman Z, Koren B, Preis M, et al. Endothelial cells are activated by angiopoeitin1 gene transfer and produce coordinated sprouting in vitro and arteriogenesis in vivoJ . Biochem Biophys Res Commun, 2007,359(2):263-268.4 Plaisier M, Rodrigues S, Willems F, et al. Different degrees o
16、f vascularization and their relationship to the expression of vascular endothelial growth factor, placental growth factor, angiopoietins, and their receptors in firsttrimester decidual tissuesJ . Fertil Steril, 2007, 88(1):176-187.5 王卫东，陈长生，蒋立新,等. 携带靶向干扰 VEGF 基因shRNA 重组腺相关病毒载体的构建和制备J. 第四军医大学学报，2007，28 （ 22）：2025-2028.6 Onda T, H
