《血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1血管内皮生长因子受体3 对宫颈癌细胞凋亡的效应研究作者：刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣【摘要 】 目的 研究血管内皮生长因子受体3 （VEGFR3 ）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 用基因重组方法构建人反义 VEGFR3 基因真核表达载体，用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela 细胞。采用 Western Blot 分析转染前后细胞中 VEGFR3 蛋白的变化。利用 Hoechst33258 染色和流式细胞仪观察转染后Hela 细胞的凋亡情况。结果 转染反义 VEGFR3 质粒后, Hela 细胞 VEGFR3 的蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率明显增加(P0.0
2、1)。结论 抑制 VEGFR3 的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡，VEGFR3 可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。 【关键词】 VEGFR3反义核酸凋亡；宫颈癌The Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor3 on the Apoptosis of Cervical CancerKey words：VEGFR3 ；Antisense nucleic 2acid；Apoptosis ；Cervical cancer血管内皮生长因子受体3(VEGFR3) 属于酪氨酸激酶受体家族, 在胚胎发生的初始阶段存在于所有的内皮细胞，随后定位于
3、小静脉和淋巴管，是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标志物1。VEGFR3主要通过与其配体 VEGFC、VEGFD 结合后，促进淋巴内皮细胞的增殖、分化，诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞的侵袭和转移2。在肿瘤组织中可见肿瘤周边的新生淋巴管、扩张的淋巴管、有癌栓的淋巴管内皮细胞 VEGFR3 呈高表达3。现有研究表明 VEGFR3 在多数肿瘤细胞上也有相应表达4，但关于其在肿瘤细胞中的效应及作用机制尚不清楚。我们自行设计了 VEGFR3 的反义重组质粒，通过电穿孔转染法瞬时转染人宫颈癌细胞株 Hela 细胞，观察反义封闭 VEGFR3 后 Hela 细胞凋亡情况的变化，对 VEGFR3 在宫颈癌细胞中的作用
4、及其机制进行初步探讨。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要试剂与仪器 培养基 DMEM、Trizol 购自美国 Gibco 3BRL 公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；MMLV 逆转录酶、pGEMT 载体购自美国 Promega 公司；PCR 引物购自上海博亚生物技术有限公司；兔抗人 VEGFR3 多克隆抗体、兔抗人actin 多克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔 IgG 均购自美国 Santa Cruz 公司；ECL 显色试剂盒购自美国 Pierce 公司。1.1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞株 Hela 购自美国典型物种保藏中心（ATCC）, 培养在含 10胎牛血清的 DME
5、M 中，置饱和湿度5CO2，37恒温培养箱中培养。1.2 VEGFR3 反义核酸载体的构建1.2.1 VEGFR3 目的基因的制备 根据 NCBI Genebank 登录的VEGFR3 的 cDNA 序列 , 利用 Primer5.0 设计 VEGFR3 胞外13 区的引物，上游引物设计 BamH酶切位点，下游引物设计EcoR酶切位点，上游引物序列为：5GGATCCGACGGCCTGGTGAGTGACTA3 下游引物序列为：5GAATTCCTTTGAGCCACTCGACGCTGATGA3 。按 Trizol说明书从胎盘组织中提取总 mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科提供)，再
6、以 RTPCR 方法大量扩增 VEGFR3 目的片断。PCR 循环条件：94预变性 5 min、94变性 30 s、56复性 30 s、72 延伸 45 s，共 35 个循环，全部循环结束4后，于 72做 10 min 终止前延伸。1% 琼脂糖凝胶电泳检测， PCR产物纯化试剂盒纯化目的片断。1.2.2 反义 VEGFR3 重组质粒的构建 按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆, 小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。1.3 基因转染及细胞分组参考 分子克隆采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至已加入适量培养基的 35mm 培养皿中，培养皿置于含 5CO2 的37孵箱,
7、 24h 后观察转染效率。细胞分组：空白组（不做处理的 Hela 细胞） ，对照组（转染空质粒 pGFPC1 的 Hela 细胞） ，实验组（转染反义质粒的 Hela 细胞） 。1.4 WesternBlot 分析转染前后细胞 VEGFR3 蛋白的表达分别提取空白组细胞、转染空载体及转染反义质粒 48h 的 Hela细胞总蛋白，参考分子克隆实验方法，按 ECL 显色试剂盒说明书曝光成像。51.5 转染细胞生物学效应的观察1.5.1 Hoechst33258 观察转染前后细胞形态学的变化 将空白组、对照组和实验组的 Hela 细胞分别置于预先放入玻片的六孔板中，待24 h 后取出玻片，PBS 漂
8、洗，固定，待干燥后由 Hoechst33258室温避光染色 30min，封片后荧光显微镜观察。1.5.2 流式细胞法检测 Hela 细胞凋亡率 分别收集空白组、对照组和实验组 48h 后的 Hela 细胞，常规方法行 PI 染色后，上机检测。1.6 统计分析 Hela 细胞凋亡率以s 表示，用 t 检验在SPSS11.5 统计软件上分析差异显著性，以 P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 VEGFR3 反义表达载体构建及鉴定用 1琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，970bp 处有明显扩增条带，其大小与预期目的基因片段相吻合，构建的 VEGFR3 反义表6达载体经 BamH，EcoR双酶切
9、产生了两条带：载体pEGFPC1 片断（4.7kb）和目的片断（970bp ） 。对酶切正确的质粒进行测序，结果表明其序列与插入方向正确，见图 1。1:1kb DNA 标准； 2:VEGFR3 PCR 产物 （970bp） ；3: 双酶切产生的条带，可见目的条带（970bp）和载体片断（4.7kb）图 1 构建质粒的酶切鉴定2.2 电穿孔法转染 Hela 细胞效率的鉴定荧光显微镜下观察，对照组和实验组的 Hela 细胞可见绿色荧光，通过高倍镜（200）计数至少 3 个视野 EGFP 发光的细胞数与该视野总细胞数的比值来得到基因的转染率，本研究基因转染率约为3040 。2.3 VEGFR3 蛋白
10、的表达Western bolt 分析转染反义表达载体前后 Hela 细胞中VEGFR3 蛋白的表达结果显示，三组细胞中均有 VEGFR3 蛋白表达（120KD） ，但空白组和对照组比较无显著差异，而实验组 Hela细胞 VEGFR3 蛋白表达明显减弱，见图 2。7图 2 Western Blot 检测空白组（A） ，对照组（B）及实验组（C）中 VEGFR3 的表达2.4 Hoechst33258 染色荧光显微镜下（200 ）观察，未经处理 Hela 细胞和转染空载体的 Hela 细胞核较大，呈弥散均匀荧光，而转染反义 VEGFR3 重组质粒的细胞核较小，可见浓染致密的颗粒状荧光，并呈现凋亡核
11、固缩形态（图略） 。2.5 流式细胞仪对 Hela 细胞凋亡的分析反义 VEGFR3 重组质粒或空载体转染 Hela 细胞 48h 后，应用流式细胞仪对 Hela 细胞进行凋亡分析，结果显示：转染反义质粒后，Hela 细胞凋亡率由(0.480.02)增加至(8.60.21)，与空白组和对照组相比，差异均具有极显著性（P0.01） ，见表 1。表 1 质粒转染后 Hela 细胞凋亡的变化注：*与对照组相比， P0.013 讨论VEGFR3 属于酪氨酸激酶受体家族，为一个高度糖基化的单链8跨膜蛋白，分子量为 180kD，有 3 部分组成，一个胞外区（配体结合区） ，一个跨膜区和一个胞内区（蛋白激酶
12、活化区） 。其中胞外区为 7 个免疫球蛋白样超二级结构，而且第 2 个 Ig 同源区为其与配体结合的区域5。VEGFR3 和其特异性配体 VEGFC/ VEGFD 结合后，发生磷酸化，可能通过激活 PI3K/Akt 和 p42/p44 MAPK 信号通路，对淋巴管内皮细胞产生特异性的致分裂作用，促使淋巴内皮细胞分裂增殖, 促进淋巴管新生6 。国内外多数研究表明，VEGFC/ VEGFR3 在肿瘤周边的新生淋巴管内皮细胞呈高表达，与肿瘤的淋巴结转移呈高度相关；VEGFC 可通过与 VEGFR3 结合而促进肿瘤细胞的侵袭和转移，阻断 VEGFC 或 VEGFR3 的作用，能够抑制肿瘤的淋巴道转移7
13、9。VEGFR3 在多数肿瘤细胞的表面也有相应的表达, 这可能与肿瘤细胞自分泌各种生长因子有关，但其对肿瘤细胞的效应目前尚不清楚。多数研究表明，VEGFR3 胞外 1 3 区为其与配体结合所必需区段，阻断该区的表达，就可抑制 VEGFR3 和配体的结合，进而阻断其后续的信号传导通路10。因此，本实验设计了带有报告基因 GFP 的 VEGFR3 胞外 13 区的反义核酸，转染人宫颈癌Hela 细胞，转染后的细胞经 Western Blot 检测其 VEGFR3 蛋白表达明显减弱；同时发现，转染 VEGFR3 反义核酸的 Hela 细胞与9空转载体的 Hela 细胞相比，差异具有极显著性（P0.0
14、1 ）,提示VEGFR3 在肿瘤细胞的增殖分化中同样也起到重要的作用。总之，我们的研究结果提示，VEGFR3 反义核酸可以促进宫颈癌细胞的凋亡，推测可能是通过降低宫颈癌细胞 VEGFR3 的表达，继而抑制 VEGFR3 所介导的信号通路发挥作用。虽然其作用机制还需进一步探讨，但我们认为，应用 VEGFR3 反义核酸既可阻断肿瘤的淋巴道转移，又可促使肿瘤细胞凋亡，不失为未来临床抗肿瘤治疗的一个新的选择。【参考文献】1 Kaipainen A, Korhonen J, Mustonen T, et al. Expression of the fmslike tyrosine kinase 4 ge
15、ne becomes restricted to lymphatic endothelium during development J. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(8): 35663570.2 Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor,VEGFC, is a ligand for the Flt4(VEGFR3) and KDR(VEGFR2) receptor tyrosine kinasesJ. EMBO J, 1996, 15(2):290298.3 Terhi Karpanen, Kari Alitalo, Lymphatic Vesseles as 10Targets of Tumor TherapyJ. J Exp Med, 2001, 194(6):F37F42.4Adhemar Longatto Filho, Albino Martins, Sandra Maria Araujo Costa, et al. VEGFR3 expression in breast cancer tissue is not restricted to lymphatic vessels J. Patholo
