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1、1血清蛋白质谱在单纯性室间隔缺损诊断中的应用【摘要】 目的 通过构建血清诊断模型，探讨血清蛋白质谱在诊断单纯性室间隔缺损中的意义。方法 采用病例对照研究设计，用CM10 蛋白质芯片检测 56 例单纯性室间隔缺损患儿、85 例儿科常见病患儿及 23 例其他先天性心脏病患儿血清，筛选血清差异蛋白，并构建诊断模型。结果 完整模型 ROC 曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为0.988、95.00、100.00、92.42 、87.18和 100.00，简化模型 ROC 曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为0.948、94.00、88.2
2、4、96.97、93.75和 94.12。简化模型与完整模型之间预测准确率、灵敏度及特异度比较，差异均无统计学意义(P0.05)。结论 利用血清蛋白质谱建立的诊断模型能够较好地区分病例与对照，对诊断室间隔缺损具有一定的发展和应用前景。 【关键词】 血清蛋白质谱； 室间隔缺损； 病例对照研究2【Abstract】 Objective To explore the value of serum protein profiling for diagnosis of isolated ventricular septal defect (VSD) through developing the seru
3、m diagnostic model. Methods Using casecontrol design, serum samples from 56 isolated VSD patients, 85 patients with common pediatric diseases and 23 patients with other congenital heart disease were detected by CM10 ProteinChip for searching the proteins that were significantly different between ser
4、um of VSD and control. Diagnostic model was established by Biomarker Patterns software. Results In the intact model and the terse model, the area under receiver operating characteristic curve, accuracy, sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were 0.988 and
5、0.948, 95.00%(95/100) and 94.00%(94/100), 100.00%(34/34) and 88.24%(30/34), 92.42%(61/66) and 96.97%(64/66), 87.18%(34/39) and 93.75%(30/32), and 100.00%(61/61) and 94.12%(64/68), respectively. Between these two models, the accuracy, sensitivity, and specificity were similar (P0.05). Conclusions The
6、 model, constructed by serum protein profiling, has capability of distinguishing the cases from the controls, and shows great potential for diagnosis of VSD.3【Key words】 Serum protein profiling; Ventricular septal defect; Casecontrol study单纯性室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)是先天性心脏病(congenital hea
7、rt disease,CHD)的常见类型，传统的影像学诊断方法不便于在人群中快速筛检出 VSD 患儿及对其早期干预。本研究采用病例对照研究设计，利用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry,SELDITOFMS)技术获取VSD 患儿与非 VSD 其他患儿的血清蛋白质谱，并以此构建 VSD 的血清诊断模型，探讨血清蛋白质谱对 VSD 的诊断意义。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 研究对象 病例为经多普勒超声心动图确诊的单纯性VSD 患儿，对照为经多普
8、勒超声心动图排除单纯性 VSD 的儿科常见病(主要为肺炎、支气管肺炎、支气管炎等)患儿和其他 CHD 患儿。病例与对照来自广西自壮族自治区妇幼保健院、广西医科大学第一、第三、第四附属医院及南宁市第一人民医院，收集时间为 2005 年3 月2005 年 10 月。病例与对照的性别、年龄及疾病诊断情况来4自医院病历，基本情况见表 1。表 1 研究对象的基本情况及在模型训练集与测试集中的分布（略）Table 1 Basic information of study objects and their distributionin training data and testing data of t
9、he model1.1.2 主要试剂与仪器 尿素、乙酸钠、三氟乙酸、乙氰、CHAPS、DTT 、TrisHCl 、HEPES 和 SPA(sinapinic acid)均购自Sigma 公司， ProteinChip Biology System(PBS c) 质谱仪及CM10 蛋白质芯片购于美国 Ciphergen 公司。1.2 方法1.2.1 血样的采集与保存 空腹采集静脉血 2 ml，经静置、离心后，取血清分装于 0.5 ml 离心管，-80 保存。1.2.2 血清样品的处理与上样 血清样品置冰上融解、离心后，取 10 l 加入含 20 l U9(9 mol/L 尿素、 2CHAPS、2
10、 mmol/L DTT、50 mmol/L TrisHCl pH9.0)的离心管中，经冰浴振荡，再加入 360 l 缓冲液(50 mmol/L 乙酸钠 pH4.0)混匀；用缓冲液恒温5孵育过的芯片每孔中加入 100 l 处理好的样品，孵育 1 h 后，再用缓冲液孵育 2 次，最后每孔加入 1 mM、pH4.0 HEPES 200 l，立即甩出；取出芯片，风干后各点加 SPA 0.5 l，重复 1 次。1.2.3 芯片的测定 PBSc 型质谱仪经 NP20 标准芯片校正后，用 Ciphergen ProteinChip 3.2 软件采集数据，设置激光强度为 225，检测灵敏度为 8，测定范围 2
11、 00050 000 Da，优化范围 2 00010 000 Da。计算机以每秒 1 G HZ 的速度从所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质质谱图。其中纵坐标为峰强度(蛋白质相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(mass to charge ratio,m/z)。1.2.4 统计分析1.2.4.1 血清诊断模型的建立与验证 分层从 VSD、儿科常见病及其他 CHD 患儿中随机抽取 60作为训练集，其余作测试集，见表 1。用 Biomarker Wizard 3.2 软件对训练集与测试集数据进行处理，找出有统计学意义(P0.05) 的蛋白峰，并形成 Pattern 文件。用 Biomarker P
12、atterns 5.0 软件及训练集 Pattern 文件，10fold交互验证，建立包含所有有意义预测变量的完整决策树诊断模型和包含 46 个意义较大的预测变量的简化模型。用测试集数据验证模型的可靠性和准确性。61.2.4.2 诊断指标的计算 ROC(receiver operating characteristic)曲线下面积取自诊断模型，诊断准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值按模型中的相关信息计算。1.2.4.3 病例与对照的均衡性检验及完整模型与简化模型的比较 用 SPSS 13.0 软件包作病例组与对照组之间性别构成和年龄(月)分布的均衡性检验(四格表检验和成组检验)及完
13、整模型与简化模型之间预测准确率、灵敏度及特异度的比较(四格表检验)，检验水准(双侧)0.05 。2 结果2.1 病例与对照的均衡性 56 例 VSD 患儿与 108 例非 VSD儿(85 例儿科常见病对照儿和 23 例其他先天性心脏病患儿)的性别构成比较(2 0.546 ，P0.460)；年龄(月)分布比较(t1.611 ， P0.109) ，差异均无统计学意义，说明病例组与对照组的性别、年龄均衡可比。2.2 完整模型的建立 34 例 VSD 与 66 例非 VSD 患儿(52 例儿科常见病和 14 例其他 CHD 患儿) 血清蛋白质质谱组成的训练集经处7理与分析，有 39 个蛋白质峰强度在两
14、组之间的差异具有统计学意义(P 0.05)。以这些蛋白质峰作为预测变量，建立完整血清诊断模型。结果显示，ROC 曲线下面积为 0.988，预测准确率为95.00(95/100),灵敏度为 100.00(34/34)，特异度为92.42(61/66) ，阳性预测值为 87.18(34/39)，阴性预测值为100.00(61/61)，m/z 8 698.80、8 570.29、6 441.97、6 640.78、3 322.54 和 7 777.61 等 6 个蛋白质峰在模型中的预测意义较大。2.3 简化模型的建立与验证 以完整模型中意义较大的 6 个蛋白质峰作为预测变量，构建简化血清诊断模型，R
15、OC 曲线下面积为0.948，预测准确率为 94.00(94/100),灵敏度为 88.24(30/34)，特异度为 96.97(64/66)，阳性预测值为 93.75(30/32)，阴性预测值为 94.12(64/68)。以测试集数据验证模型，ROC 曲线下面积、预测准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为0.865、93.75(60/64)、81.82 (18/22) 、100.00(42/42)、100.00(18/18)和 91.30(42/46)。病例与对照在简化决策树模型中的分组情况见图 1。2.4 完整模型与简化模型预测准确率、灵敏度及特异度比较 完整模型与简化模型之
16、间预测准确率(95.00 vs 94.00)、灵敏度(100.00 vs 88.24)及特异度(92.42 vs 96.97)经检验，2值分别为 0.756、2.391 和 0.603，P 值分别为 0.756、0.122 和80.437，差异均无统计学意义。图 1 简化决策树模型中病例与对照的分布（略）Figure 1 Distribution of cases and controls in the model3 讨论VSD 是最常见的 CHD 类型(广西 VSD 占 CHD 的41.521)，尽管现有的影像学诊断方法，对 VSD 的识别都具有较高的灵敏度及特异度，但不便用于筛查，不能从人群中快速筛检出 VSD 患儿并对其早期干预。而血清中所包含的大量的、可作为疾病标志物的蛋白质或多肽2,3 ，以及被视为各种疾病血清蛋白质组学研究及发展疾病
