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1、1蛋白酶激活受体 2 激动剂诱导上皮细胞分泌 MCP【关键词】 蛋白酶激活受体 【Abstract】 AIM: To investigate the actions of agonists of proteinase activated receptors (PAR)2 on the secretion of monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) from human lung epithelial cells. METHODS: A549 cells were cultured in a 12well culture plate. The chal
2、lenge was performed by adding various concentrations of PAR2 agonists or their reverse peptides into each well, respectively. After 2 h, 8 h or 16 h, the reactions were terminated by removal of the supernatant from each well. A Sandwich ELISA was used to determine the levels of MCP1 in supernatants.
3、 RESULTS: Following 16 h incubation, PAR2 agonists SerLeuIleGlyLysValamide (SLIGKV) and transcinnamoylLeuIleGlyArgLeuOrnamide (tcLIGRLO) were able to induce concentration dependent secretion of MCP1. The maximum release of MCP1 was 13 fold more than the baseline release. The reverse PAR2 agonists ha
4、d little effects on MCP1 release. The time course showed that the actions of PAR2 agonists initiated at 2 h and reached their peaks at 16 h. CONCLUSION: Agonists of PAR2 are potent secretogogues of 2MCP1 release from cultured human lung epithelial cells. Their antagonists may possess the ability to
5、inhibit airway inflammation. 【Keywords】 proteinaseactivated receptors；epithelial cell line; monocyte chemoattractant protein1 【摘要】 目的：探讨蛋白酶激活受体（PAR）2 激动剂对人上皮细胞单核细胞趋化蛋白 1（MCP1）分泌的影响. 方法：人肺上皮细胞系 A549 细胞分别接种于 12 孔培养板各孔内，并分别用不同浓度的 PAR2 激动剂，反 PAR2 激动剂进行刺激 . 刺激时间为 2, 8和 16 h. 用 ELISA 方法检测上清液中的 MCP1 水平. 结果
6、：经过16 h 的培养，PAR2 激动剂 SLIGKV 和 tcLIGRLO 均可引起浓度相关性 MCP1 释放增加，tcLIGRLO 引起的最大 MCP1 释放量达基础分泌量的 13 倍. 反 PAR2 激动剂对 MCP1 释放的影响较小. 时间相关曲线表明，PAR2 激动剂的作用从 2 h 开始，16 h 达高峰. 结论：PAR2 激动剂是高效的人肺上皮细胞 MCP1 的促分泌剂. 其拮抗剂有可能具有抑制呼吸道炎症的作用. 【关键词】 蛋白酶激活受体；上皮细胞系；单核细胞趋化蛋白 1 0 引言 上皮细胞可释放许多前炎因子1 ,作为首先接触吸入性抗原的呼吸道上皮细胞，能够释放许多与炎症性疾病
7、密切相关的细胞因子，如 MCP1，IL1，IL6 ，IL8，GMCSF，MIP，RANTES 和3eotaxin 等2. 最近发现在呼吸道上皮细胞上有 PARs 的表达3 ，提示在呼吸道上皮细胞的 PARs 和白介素分泌间可能有某种联系. 由于 PAR2 激活被发现与某些呼吸道炎症性疾病有关4 ，因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系 A549 细胞探讨 PAR2 激动剂对上皮细胞 MCP1 释放的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 PAR2 激动剂 SLIGKV，tcLIGRLO 和反 PAR2 激动剂VKGILS，tcOLRGIL 由美联生物科技有限公司（西安）合成; 青链霉素(Sigma
8、 公司);DMEM 培养液、胎牛血清（ FBS） 、胰蛋白酶EDTA 消化液均购自 Gibco 公司. 1.2 方法 人肺癌上皮细胞系 A549 细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于 50 mL 培养瓶内，用 DMEM 完全培养液（含 100 mL/L FBS，100 mg/L 青/链霉素） ，于 37,50 mL/L CO2 培养箱中培养. 待细胞铺满瓶底后，用 2.5 g/L 胰蛋白酶 EDTA 消化液消化，将获得的细胞分种于 12 孔培养板各孔内，用 1 mL 完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液培养 16 h. 分 5 组：SLIGKV，tcLIGRLO ，VKGILS
9、 ，tcOLRGIL 各 1 组和激发对照组. 激发实验向每孔内加 0.1100 mol/L 4 种浓度的 PAR2 激动剂或反 PAR2 激动剂，每种药物浓度重复 2 孔,分别培养 2,8 和 16 h 后收获上清液-80 冻存 ,用于 ELISA 检测. 每组实验重复 5 次. 人4MCP1 检测用人 MCP1 ELISA 检测试剂盒（ Biosource）, 检测上清液 MCP1 水平，并用酶标仪于 450 nm 波长处测定吸光度 A 值. 统计学处理: 全部统计分析均采用 SPSS(11.0 版)软件分析，数据以 xs 表示. 所用统计方法为单因素方差分析（ one way ANOVA
10、） ，组间方差不齐时，两两比较采用 Dunnetts T3 检验；方差齐时，采用最小显著差法. P0.05 为统计学上有显著性差异 . 2 结果 培养 16 h，PAR2 激动剂 SLIGKV 和 tcLIGRLO 均可引起浓度相关性 MCP1 释放增加， tcLIGRLO 在浓度 1 mol/L时就可引起 MCP1 释放增加， 增加到 100 mol/L时诱导 MCP1 的释放量比基础分泌量增加了 13 倍. 反 PAR2 激动剂 tcOLRGIL 在浓度为10 mol/L时也能引起 MCP1 释放增加，但与同浓度的 tcLIGRLO相比，诱导 MCP1 的释放量较少. SLIGKV 在 1
11、 mol/L时也可引起MCP1 分泌增加，但它的作用强度比 tcLIGRLO 要弱，两者间有显著差异(P0.05). 反 PAR2 激动剂 VKGILS 对 MCP1 的释放无影响（Fig 1）. tcLIGRLO 与 A549 细胞培养 2,8 和 16 h 显示，随着药物作用时间的延长，MCP1 释放量显著增加(P0.05)，反PAR2 激动剂 tcOLRGIL 随药物作用时间的延长， MCP1 释放量也有少量增加（Tab 1）. SLIGKV 引起 MCP1 释放也随时间而增加(P0.05）. 3 讨论 PARs 属 G 蛋白耦联受体家族中的亚类，目前有 PAR1,2,3,45四个成员组
12、成，它的 N 末端可被丝氨酸蛋白酶裂解而成为一个新的可自我激活的系锁配体. 激活 PAR2 的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子a,a5. PAR2 还可被与系锁配体结构一致的含 5,6 个氨基酸残基的多肽激活，主要有 SLIGKV 和tcLIGRLO6. MCP1 属趋化因子 CC 亚家族中的一员，主要由上皮细胞、单核细胞、成纤维细胞等细胞产生，可以趋化激活 T 细胞和单核细胞，激活嗜碱性粒细胞，从而参与炎症过程. PAR2 激动剂对呼吸道上皮细胞 MCP1 分泌的促进作用表明在肥大细胞分泌的类胰蛋白酶和呼吸道上皮细胞之间存在着直接的联系，又一次间接证明了肥大细胞在哮喘和慢性
13、阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用. PAR2 激动剂可引起高达 13 倍的 MCP1释放，表明蛋白酶对 MCP1 的释放促进作用是高效的，其诱导的MCP1 释放量（600 ng/L）足以在体内引起炎症反应. 同时还提示一个更广义的概念，蛋白酶除了能够水解组织中的特异性底物外，还可以通过 PAR2 受体刺激细胞分泌促炎介质，从而加重炎症的发展，为进一步理解炎症性介质间的相互作用提供了新的思路. tcLIGRLO 比相同浓度的 SLIGKV 的作用强，除了其分子本身的作用外，可能与多肽上连上一个肉桂酰基而使该分子不易被细胞分泌的蛋白酶等水解有关. PAR2 激动剂对 MCP1 分泌的刺激作用
14、明显强于它们相对应的反肽，更说明这种刺激作用是具有特异性的，而不是对肽类的一种无选择性的反应. 从时间关系曲线上看，PAR2 激动剂对 MCP1 分泌的刺激作用是一个比较缓慢的过程，这可能表明分6泌出的 MCP1 是由上皮细胞新合成的，而不是原有贮存的 MCP1的单纯释放. 但具体分泌机制还有待于进一步探索. 【参考文献】 1 宋宗明, 惠延年,瞿佳,等. 原位杂交法检测视网膜色素上皮细胞炎前因子 mRNA 的表达J . 第四军医大学学报, 2001;22(13):1223-1226. Song ZM, Hui YN, Qu J, et al. Detection of mRNA produc
15、tion of proinflammatory factors in cultured RPE using in situ hybridization J. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(13):1223-1226. 2 Asokananthan N, Graham PT, Fink J, et al. Activation of proteaseactivated receptor (PAR)1, PAR2, and PAR4 stimulates IL6, IL8, and prostaglandin E2 release from human respir
16、atory epithelial cellsJ. J Immunol, 2002; 168: 3577-3585. 3 牛青霞，何韶衡. 蛋白酶活化受体 2 的研究进展J . 生理科学进展，2003;34（4 ）：373-375. Niu QX, He SH. Proteaseactivated receptor2J. Prog Physiol Sci, 2003;34(4):373-375. 4 Schmidlin F, Amadesi S, Dabbagh K, et al. Proteaseactivated receptor 2 mediates eosinophil infiltration and hyperreactivity in allergic inflammation of the airwayJ. 7J Immunol, 2002; 169:5315-5321. 5 OBrien
