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1、1蛋白酶体抑制剂 MG132 对 PC12 细胞的增殖抑制作用作者：蔡同建，陈景元，李妍，季爱玲，杜可军，骆文静 【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12 细胞；帕金森病；细胞凋亡【Abstract】 AIM: To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the proliferation and apoptosis of dopaminergic PC12 cells. METHODS: PC12 cells were treated with MG132 at different concentrations for 3
2、 d. The effect of MG132 on the proliferation of PC12 cells was analyzed through MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of PC12 cells was analyzed through Giemsa staining and flow cytometry. RESULTS: Treated for a same period （3 d）, the inhibitory effect of MG132 on PC12 cell proliferatio
3、n enhanced with the increment of the concentration of MG132（0, 1, 2.5, 5, 10, 20 mol/L）. The inhibitory rate exceeded 40% when the MG132 concentration was 2.5 mol/L, and the 50% inhibiting concentration （IC50）was 3.78 mol/L. MG132 also induced the apoptosis of PC12 cells obviously. The apoptosis ind
4、ex of the cells treated by MG132 2at 2.5 mol/L for 3 d was 24.7% examined by Giemsa staining and 25.6% by flow cytometry, that of the control cells was 1.3% and 0% respectively. CONCLUSION: MG132 can inhibit the proliferation of dopaminergic PC12 cells and lead to apoptosis. The disfunction of prote
5、asome may do harm to the existence of dopaminergic cells.【Keywords】 proteasome inhibitor; PC12 cells; Parkinson disease; apoptosis【摘要】 目的： 了解蛋白酶体抑制剂 MG132 对多巴胺能细胞PC12 增殖和凋亡的影响. 方法： 用不同浓度的 MG132 处理 PC12细胞 3 d，通过 3（4，5 二甲基噻唑 2）2，5 二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法检测 MG132 对 PC12 细胞增殖的影响，通过姬姆萨染色法和流式细胞术检测 MG132 对 PC12
6、 细胞凋亡的影响. 结果： 在作用时间相同（3 d）的条件下，随着 MG132 浓度的增高（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 mol/L） ，对 PC12 细胞增殖的抑制作用逐渐增强. 当 MG132 浓度达到 2.5 mol/L 时，对 PC12细胞的抑制率超过 40%, IC503.78 mol/L. 同时，MG132 能够明显诱导 PC12 细胞凋亡： 姬姆萨染色显示，浓度为 2.5 mol/L的 MG132 作用 3 d，细胞凋亡率为 24.7%，而对照为 1.3%；流式细胞术分析结果表明，浓度为 2.5 mol/L 的 MG132 作用 3 d，细3胞凋亡率为 25.6%，而
7、对照为 0%. 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132 能够抑制多巴胺能细胞 PC12 的增殖并诱导细胞凋亡，蛋白酶体活性的丧失可能影响到多巴胺能细胞的生存.【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12 细胞；帕金森病；细胞凋亡0 引言帕金森病（parkinsons disease, PD）是最常见的神经系统退行性疾病之一，严重危害患者身体健康和降低患者的生活质量1-2. PD 的病因和发病机制至今不够明确. 越来越多的证据表明，多巴胺能神经元内蛋白质的损伤和功能异常蛋白的蓄积在散发性 PD 的发病过程中起着重要的作用3. 蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解
8、酶，在泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway, UPS）中起催化作用4-5. 本研究以多巴胺能细胞 PC12 为研究对象，观察蛋白酶体抑制剂 MG132 对 PC12 细胞的增殖和凋亡的影响，以探讨蛋白酶体活性异常在 PD 发病过程中的作用，为阐明 PD 的发病机理提供新的实验依据.1 材料和方法41.1 材料高分化型 PC12 细胞购于中国科学院上海细胞所；新生牛血清（奥地利 PAA 公司） ；DMEM 培养基干粉（美国 Gibco 公司） ；MTT 、MG132（美国 Sigma 公司） ； 6 孔培养板（丹麦NUNC 公司） ；NU2500E 型 CO2
9、 孵箱（英国 Forma Scientif 公司） ；酶联免疫检测仪（江苏国营华东电子管厂）.1.2 方法1.2.1PC12 细胞的培养与传代细胞在加入 100 mL/L 小牛血清,100 U/mL 青霉素的 DMEM 培养液中，37, 50 mL/L CO2 常规培养. 待细胞长满至培养瓶底面积 80%之后传代.1.2.2 细胞毒性试验（MTT 法）取对数生长期的细胞，接种于 96孔板中. 第 2 日换含有 MG132 0, 1, 2.5, 5, 10 和 20 mol/L 的培养液，继续培养 3 d，加入 MTT（5 g/L, 20 L/孔） ，继续培养 4 h，终止培养，小心吸弃培养孔内
10、上清液，每孔加入 150 L 的二甲基亚砜（DMSO） ，振荡摇匀，使 MTT 产生的蓝色结晶充分溶解，在酶标仪上以波长 490 nm 测定各孔 A 值. 细胞增殖抑制率按照下式进行计算（对照组为 0 剂量组，实验组为不同浓度 MG132 作用组）： IR（ %）=（A 对照组-A 实验组）/A 对照组100.1.2.3 姬姆萨染色法观察取对数生长期的细胞，常规爬片. 24 h5以后，分别以正常培养液和加入 MG132 2.5 mol/L 的培养液继续培养 3 d，然后进行 Giemsa 染色. 染色方法： 0.01 mol/L PBS 清洗玻片 35 次；利用卡诺固定液（甲醇冰醋酸31）固定
11、 20 min；用新配制的 Giemsa 染色液染色 20 min；自来水流水冲洗，二甲苯透明，光镜下观察染色效果，并拍照. 结果判断： 发生凋亡的细胞以及凋亡小体呈紫蓝色深染，容易在光镜下辨认. 每张盖玻片选择 3 个视野，每个视野计算 100 个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞的阳性指数.1.2.4 流式细胞术检测将对照组和实验组（2.5 mol/L 处理 3 d）的细胞分别制成单细胞悬液，用预冷的 PBS 洗涤 2 次；700 mL/L 的乙醇 4固定 30 min. 流式细胞术测定细胞 DNA 含量，进行细胞周期分析和凋亡率的比较.统计学处理： SPSS11.0
12、 统计软件进行统计分析. MTT 实验结果用 xs 表示，假设检验用方差分析，各实验组与对照组之间的比较使用 Dunnettt 检验；姬姆萨染色法的实验结果用 u 检验，以P0.05 为有统计学意义 .2 结果2.1MTT 实验结果显示，不同浓度的 MG132 作用于细胞 3 d 后，在 120 mol/L 浓度范围内，MG132 对 PC12 细胞呈浓度依赖性6的增殖抑制作用（IC503.78 mol/L）. 作用第 3 日, 2.5 mol/L和 5 mol/L MG132 对细胞的抑制率分别为 43.47%和66.67%（表 1）.表 1 不同浓度的 MG132 对 PC12 细胞增殖的
13、抑制作用2.2 姬姆萨染色法检测细胞凋亡浓度为 2.5 mol/L 的 MG132 作用 3 d 后，镜下观察，含有 MG132 的实验组细胞总数明显低于对照组. 对照组基本上难以看到凋亡细胞，而 MG132 实验组随处可见紫蓝色深染的凋亡细胞（图 1）. 通过计算，对照组细胞凋亡率为1.3%，MG132 实验组细胞凋亡率为 24.7%. MG132 实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P0.05 ）.2.3 流式细胞仪检测结果显示，2.5 mol/L 蛋白酶体抑制剂MG132 作用于 PC12 细胞 3 d 后，与对照组相比，S 期细胞所占比例有所下降，从 28.7%下降到 24.6%. 对照组
14、未见凋亡峰，而加入MG132 的实验组有典型的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为 25.6%（图2）.3 讨论在临床上，PD 主要病理改变为黑质、纹状体多巴胺能神经元的进行性变性、死亡，导致纹状体内多巴胺浓度的明显下降6. 由7此可见，多巴胺能神经元的增殖和凋亡的变化在 PD 的发病中起重要作用. PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，高分化型的 PC12 细胞在形态、生理、生化功能方面接近于中脑多巴胺神经元，因此在国内外常作为多巴胺神经元的细胞模型3. 近期的研究表明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积是 PD 发病的机理之一，传统的研究着重于这些异常蛋白的形成过程，很少关注其代谢和降解途径.蛋白酶体是一
15、种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在 UPS 中起催化作用. UPS 是蛋白质选择性降解的主要方式，可以清除真核细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质，维持细胞内环境的稳定，在维持细胞正常功能方面发挥着重要作用7-8. MG132 是蛋白酶体抑制剂，可以抑制 UPS 中起主要催化作用的蛋白酶体的催化活性，从而阻断了 UPS对异常蛋白的降解. 在 PD 的研究过程中，人们已经发现，synuclein, Parkin 和 UCHL1 等基因的突变可能与一些家族性 PD的发生有关. 而这三种基因都与 UPS 的功能有关 9.本研究结果显示，一定浓度的蛋白酶体抑制
16、剂 MG132 对 PC12细胞的增殖有明显的抑制作用. 在引起细胞增殖抑制的同时，MG132 还诱导细胞凋亡. 姬姆萨染色和流式细胞术结果均显示，浓度为 2.5 mol/L 的 MG132 作用 3 d 后，可明显诱导 PC12 细胞的凋亡. 通过抑制蛋白酶体的活性，直接导致了 PC12 细胞增殖的抑8制以及凋亡率的增高. 这表明，作为维持细胞内稳态的重要物质，蛋白酶体的功能是否正常至关重要，蛋白酶体活性的改变能够对PC12 细胞的生存产生重要的影响，正常的蛋白酶体活性对维持神经系统的正常功能有着重要的意义. 本实验结果再次证明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积在 PD 的发病过程中起着不可忽视的作用，保持多巴胺能神经元内异常蛋白的降解系统 UPS 功能的正常，可以为 PD 的预防提供一个新的思路.【参考文献】 1 Lieberman A. Depression in Parkinsons dis
