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1、1荧光定量 PCR 技术在临床肺结核防治中的应用【摘要】 目的 建立荧光定量 PCR 检测结核分枝杆菌方法，评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法 针对结核分枝杆菌保守序列 IS6110 基因设计引物和探针，建立荧光定量 PCR 方法。分别以荧光定量 PCR、集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊病人随访的痰标本，比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果 荧光定量 PCR 的检测灵敏度为 4 Copies/反应，远高于抗酸染色法和集菌培养法。荧光定量 PCR 法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为 64.29、35.12 和12.5。病人治疗效果的随访检
2、测结果显示，结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势。结论 荧光定量 PCR 方法具有快速、敏感和特异性高的特点，可以快速、及时获取病人服药后的治疗效果，为医生的后续督导治疗提供依据，具有重要的临床意义。 【关键词】 分枝杆菌 荧光定量 PCR 基因诊断 疗效观察 【Abstract】 Objective To evaluate the prospect of real-time PCR in the clinical diagnosis and efficiency evaluation of treatment to lung tuberculosis. Method Real-time PCR
3、 was established to detect M. tuberculosis specific sequence of IS6110. The result was compared with acid-fast staining and cultivation. We used the real time PCR during clinical 2treatment to the patients who diagnosed as lung tuberculosis. Result Real-time PCR is more sensitive and positive rate (
4、64.29%) was significantly higher than cultivation (35.12%) and acid-fast staining (12.5%). The copy of TB diminished obviously in the treatment follow-up. Conclusion The real-time PCR has high sensitivity and specificity in the detection of M. tuberculosis. The method could feedback the efficiency a
5、nd provides sensible advice for treatment in time. 【Key words】 Mycobacterium tuberculosis Real-time PCR Gene diagnosis Efficiency evaluation of treatment 目前结核病仍是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人 2000 多万，其中 95在发展中国家，我国是 22 个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第二位，每年因结核病死亡的人数达到 15 万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展13。 结核分枝杆菌的实验
6、室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方法的检出率低、培养周期长，难以满足临床需要。荧光定量 PCR 是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点，得到了广泛的应用4，5。本研究建立了荧光定量3PCR 检测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量 PCR 在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行了评价，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 标本 1.1.1 疑似病人 采集 20092010 年 5
7、 月到深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者的痰液标本 168 份，其中男性 115 份，女性53 份，年龄 1560 岁。 1.1.2 确诊患者 选择临床确诊肺结核病人，有低热、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺结核表现，X 线健康检查肺部有结核病灶，实验室检测结果为阳性。为确保样本采集的连贯性，在争取病人同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近病人。跟踪随访采集深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者漱口后痰液，选取 3例活动性肺结核患者，采集病人服药前 1 天的晨痰，随访中 17日内每天采集 1 次，后续间隔 25 天采集 1 次。 1.2 仪器 Bact/Alert 3D 全自动细菌快速培
8、养和药敏检测系统、Heraeus 低温冷冻离心机 Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer（岛津） 、7500 荧光定量 PCR 扩增仪（Applied Biosystems） 、凝胶成像系统（英国 UVI tec） 。 1.3 抗酸染色法与集菌培养法 操作参考结核病诊断细菌学检验规程6进行。 1.4 痰液 DNA 的提取 取 0.5ml 痰标本加入 2 倍样本体积 4的NaOH，液化 10min 后 15000r/min 离心 5min，去上清液；向沉4淀中加入 0.5ml 灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min 离心2mi
9、n，去上清液，重复洗涤 3 次；沉淀中加入 50l DNA 提取液（1NP-40 + 2Triton X-100）4，充分振荡混匀，100水浴10min；待冷却至室温， 15 000r/min 离心 5min，取上清液备用。1.5 荧光定量 PCR 方法710 1.5.1 引物与探针设计 针对 IS6110 基因设计引物与探针，上游引物：5-GTC GCC CGT CTA CTT AAT G-3，下游引物：5-GCG GAT TCT TCG GTC GTG-3，产物长度为 107bp。探针：5FAM-CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG-DABCYL3，由上海
10、基康生物技术有限公司合成。 1.5.2 反应条件 反应体系（40l）：4.0l10buffer，7.0mmol/LMg2+ ，200mol/L dNTP，0.2mol/L 上下游引物，0.2mol/L 探针，4lLDNA 模板，2.5U Taq DNA 聚合酶。扩增条件：94 3min，94 20s，52 20s，72 20s，40 次循环。试验设定阳性对照、弱阳性对照与空白对照（no template control, NTC） 。按照荧光定量 PCR 分析软件设定基线（baseline）与阈值（threshold） ，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线。 1.5.
11、3 标准品制备 以结核分枝杆菌 H37Ra 为参考菌株，PCR 扩增 IS6110 基因并克隆到质粒载体。提取纯化重组 DNA，10 倍梯度稀释至 107Copies/ml 作为强阳性标准品，103Copies/ml 作为5弱阳性标准品。 1.5.4 特异性 以结核分枝杆菌 H37Ra 为阳性标本，提取牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌为模板检测引物与探针的特异性。 1.5.5 灵敏度与标准曲线绘制 抽提标准品 DNA，10 倍系列准确定量稀释 102107Copies/ml 的 DNA 模板，分别取 4l
12、进行荧光定量 PCR 扩增。 1.5.6 结果判定 荧光定量 PCR 扩增曲线规则，呈对数增长， Ct值36 即可判定为阳性；如扩增曲线不规则或 Ct 值40 ，报告为阴性；如 Ct 值在 3640 之间，且扩增曲线呈对数增长，样本重复测定，如 Ct 值仍在 3640 之间报告为阴性。 2 结果 2.1 荧光定量 PCR 法的特异性 结核分枝杆菌 H37Ra 出现特异扩增，凝胶电泳出现 107 bp 条带。对该 PCR 产物进行测序，序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列，其他非结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。 2.2 荧光定量 PCR 法的灵敏度与线性 以 10 倍梯度稀释配制原始拷贝数 1021
13、07Copies/ml 的标准品系列，取 4l 进行分子信标荧光定量 PCR，绘制标准曲线，其回归方程为 Ct=-3.61344 logC0 + 45.78456，线性范围为4102107Copies/ml，r=0.99503 ，Ct 值与 DNA 模板含量呈6线性关系。经多次重复试验，最低可检测 4 Copies/反应。如图 1。图 1 荧光定量 PCR 法检测结核分枝杆菌标准曲线 2.3 肺结核的诊断 采集 168 份疑似结核病人痰标本，集菌培养法和涂片染色法阳性检出率分别为 35.12（ 59/168） 、12.5（21/168） ，荧光定量 PCR 法阳性检出率64.29（108/16
14、8 ） ，显著高于抗酸染色法和培养法，漏检率低。对抗酸染色法和培养法阳性的样本，荧光定量 PCR 法的灵敏度分别为 100和 95.4。对于非结核病人来源的痰标本，荧光定量 PCR方法检测结果为阴性，符合率为 100。 2.4 随访检测 随访周期 3 个月，对 5 例活动性肺结核进行了动态检测。荧光定量 PCR 检测结果显示，随着临床治疗方案的进行，病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势（即 Ct 值增加） 。图 2 为随访期间连续 4 次测定病人标本的结果， Ct 值分别为26.60、27.58、28.25、29.14，呈连续增加。为保证检测结果的准确性，每份晨痰都进行平行测定。 图
15、2 随访期间荧光定量 PCR 连续测定病人标本扩增曲线 随访期间，3 例病人转阴，2 例仍为阳性。病例 1 为男性，23 岁，发病时间约 2 个月，病程较短，病情较轻，治疗前 X 线检查未见异常，痰涂片检查：涂阳 1+，服药后在 1 个月内迅速转阴，结核分枝杆菌从 105copies/ml 减少到不能检出。病例 2、3、4、5 治疗7前 X 线检查均有不同程度的异常，病程较长，患病时间在半年以上。如病例 2 为男性，41 岁，X 线检查右上肺可见斑片状、条索状模糊影，密度不均，边缘不清，其中间见一空洞，无栗粒。痰涂片检查结果为涂阳 3+，诊断为 III 型涂阳肺结核患者。经过 3 个月的治疗，
16、4 例病人咳嗽、咳痰等临床症状均有减轻。病例 2 和 3 涂片与荧光定量 PCR 检测结果均转阴性，病例 4、5 仍为阳性。图 3 为随访各病例结核分枝杆菌 Ct 值随时间的变化曲线。 3 讨论 荧光定量 PCR 是近年发展迅速的基因诊断技术。与传统检测方法比较，荧光定量 PCR 的阳性检出率有显著提高，本研究中荧光定量 PCR 与传统的培养法和涂片法的阳性检出率分别是64.29、35.12、12.5，与文献报道一致 1-7。而且荧光定量PCR 法极大地缩短了检测的时间，有助于对病人确诊并及时采取治疗手段。目前临床所用实验室检测方法十分落后，已成为阻碍我国结核病防治工作顺利展开的重要原因，在基层建立和推广特异性强、灵敏度高的检测方法非常必要。在对 5 名确诊结核病人的随访中发现，经过 3 个月的治疗，3 名病人痰液中不再有结核分枝杆菌检出。另 2 名病人由于感染时间较长，并有较大
