《膀胱移行细胞癌中p16基因的改变》由会员分享，可在线阅读，更多相关《膀胱移行细胞癌中p16基因的改变（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1膀胱移行细胞癌中 p16 基因的改变关键字：细胞癌 p16 基因定位于人染色体 9p21，编码相对分子质量为16000 的蛋白产物，作为 CDK4 的抑制因子，抑制细胞周期的G1 S 转换。研究表明，基因的缺失是 p16 基因在人类多数肿瘤中失活的主要机制1， 2 ，有报道 p16 基因在膀胱肿瘤中的缺失率仅为 193 ，p16 基因在膀胱肿瘤中是否存在其它失活机制？最近 Merlo 等4在一些较少发生 p16 基因缺失和突变的人类肿瘤中，如小细胞肺癌，发现高比例（78）的 p16 基因 5CpG 岛甲基化而失去转录活性，提示 p16 基因的 5CpG 岛甲基化有可能参与膀胱肿瘤的形成过程。
2、为此，本实验对 p16 基因在膀胱肿瘤中的失活机制进行研究，报道如下。 材料与方法 1标本来源：标本取自天津医科大学附属第二医院泌尿外科及河南省平顶山市第一人民医院泌尿外科 19951996 年经手术切除的膀胱肿瘤标本，经病理证实为膀胱移行细胞癌。以相应瘤周正常膀胱粘膜作对照。每 1 例肿瘤标本分为 2 份1 份放入液氮冻存另 1 份用 4甲醛固定常规石蜡包埋复查病理。肿瘤分期按UICC*TNM 标准分为浅表性肿瘤原位癌T1 组共 18 例，浸润性肿瘤 T24 组共 34 例 ;病理分级按 WHO 方法 级 13 例级20 例级 19 例。 22Southern 杂交及放射自显影：应用酚-氯仿
3、抽提法提取肿瘤组织基因组 DNA，经限制性核酸内切酶 TaqI 完全消化，电泳并转移至硝酸纤维素膜经典方法进行 Southern 杂交p16cDNA探针(960bp)由美国冷泉港实验室 DavidBeach 博士惠赠。 3聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP ）分析：（1）引物设计（经微机检验符合设计要求，合成于中科院微生物研究所）：（S）：5 -TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGC-3， （AS）：5-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3 ，扩增包括整个外显子 1 在内的 281bp 片段。 （S ）：5-CTGACCATTCTGTTCTCTCTGG-3，
4、（AS）：5-CATGGTTACTGCCTCTGGTGC-3，扩增包括整个外显子 2 在内的 302bp 片段。 （2）实验步骤参阅文献5 ，PCR 扩增仪为美国PE9600 型。 4DNA 甲基化分析 5：将大分子量基因组 DNA 先应用甲基化敏感性核酸内切酶（Sma）酶切，再用甲基化非敏感性核酸内切酶（Xba）酶切，电泳并转移至硝酸纤维素膜。p16 外显子 1 探针（经 PCR 扩增 p16 外显子 1 产生）用随机引物法标记-32PdCTP 经典方法进行 Southen 杂交及放射自显影。 结果 1Southern 杂交结果显示，p16 基因为 3.7kb 杂交带，2.2kb 杂交带为与
5、 p15 基因的非特异杂交带（图 1） 。11 例肿瘤存在 p16 基因缺失，缺失率为 21.15。p16 基因的缺失与膀胱肿瘤3病理分级及临床分期的关系。讨论 膀胱肿瘤的自然病程还不十分清楚，因为无法确定哪一部分表浅性肿瘤将会进展成为浸润性肿瘤。临床资料的研究表明，膀胱肿瘤可能不是通过单一途径而进展，浸润性肿瘤可能来自较少恶性进展的表浅乳头状肿瘤6 ，或来自较易侵袭转移的原位癌 7 。Spruck 等8分析了表浅性膀胱肿瘤的遗传物质的改变，提出了浅表性膀胱肿瘤恶性进展的两个不同的分子通路：表浅乳头状肿瘤中常存在 9 号染色体的改变， p53 基因突变少见，而原位癌中存在与浸润性肿瘤一致的 p
6、53 基因的突变率，9 号染色体的改变少见。由于两类肿瘤遗传物质改变的差异，表浅乳头状肿瘤很少恶性进展，而原位癌常发生浸润。而且还指出，原位癌在发展过程中一旦出现9 号染色体的改变则可能发展成为恶性度更高的肿瘤。p16 基因是定位于人染色体 9p21 区域的一个重要的抑癌基因。我们的研究结果表明，52 例膀胱移行细胞癌中 11 例存在 p16 基因的缺失缺失率为 21.15%与 Spruck 等3 报道的结果相符。且 p16 基因的缺失多见于早期、高分化的肿瘤，而在浸润性肿瘤中少见。说明p16 基因的缺失是膀胱肿瘤发展过程中的早期事件。而且在早期肿瘤中只有 Ta 和 T1 期肿瘤出现 p16
7、基因的缺失，原位癌中则未检测到 p16 基因的缺失。以上研究结果进一步支持了膀胱肿瘤的发生和发展可能是通过两种不同分子通路的假说。 应用 PCR-SSCP 技术，我们对肿瘤组织中 p16 基因97（外显子 1、2）的编码序列进行突变分析，结果仅发现 1 例4肿瘤外显子 2 出现泳动变位。由于受 PCR-SSCP 本身灵敏性的限制或 p16 基因的突变热点可能在 p16 外显子 1、2 之外的区域，可能会漏掉对一些突变肿瘤的检测。但结合最近的研究结果，除食管癌和胰腺癌外，p16 基因在人类其它肿瘤中的点突变率均很低2，9，10 ，因此，我们认为基因的点突变可能不是 p16 基因在膀胱肿瘤中失活的主要机制。 染色体区域性甲基化与抑癌基因的功能丢失有关，基因启动子区域 5CpG 岛甲基化常伴有基因的转录失活，p16 基因外显子1 启动子区域位于一典型的 CpG 岛。我们的研究结果表明，正常膀胱粘膜中未发现 p165CpG 岛甲基化存在，52 例膀胱肿瘤组织中19 例存在 p16 基因 5CpG 岛甲基化，甲基化率为 36.54。且p16 基因 5CpG 岛甲基化多见于晚期、低分化的肿瘤，在早期、高分化肿瘤中少见，提示 p16 基因 5CpG 岛的甲基化是膀胱肿瘤发展过程中的晚期事件，在各种致瘤因素引起膀胱肿瘤发生后，一旦获得 p16 基因的甲基化失活则可促进肿瘤的恶性进展。
