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1、1苦参碱诱导 A549 细胞凋亡的机制研究作者:范临夏陶晓南蔡曦光刘华 【摘要 】 目的:观察苦参碱抑制人肺腺癌细胞 A549 的增殖作用,并探讨其分子机制. 方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、电子显微镜、细胞周期分析法检测 A549 细胞凋亡;采用流式细胞术(FCM)测定细胞 Bcl2, Bax 及 caspase3 蛋白表达水平. 结果:苦参碱对 A549 细胞的增殖具有明显的抑制作用,并呈现剂量和时间依赖关系;电镜观察呈现典型的凋亡形态改变;细胞周期分析显示细胞增殖发生 S/G2 期阻滞;苦参碱能显著降低 Bcl2 蛋白表达(P0.01);而显著升高 Bax 蛋白表达水平及 ca
2、spase3 活性. 结论:苦参碱可显著抑制 A549 细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与下调 Bcl2 表达水平改变线粒体膜通透性有关. 【关键词】 苦参碱;肺腺癌;凋亡;Bcl2 ;Bax;caspase3 【Abstract】 AIM: To study the inhibitory effect of matrine on the proliferation of A549 lung adenocarcinoma cells and its mechanism. METHODS: MTT assay,electron microscopy, and cell cycle analys
3、is were used to examine the apoptosis in A549 cells. Expression levels of Bcl2, Bax and caspase3 proteins were measured with flow cytometry. RESULTS: Matrine exerted antiproliferative activity on A549 2cells in a dose and timedependent manner. Typical apoptotic morphological changes of A549 lung ade
4、nocarcinoma cells were observed by electron microscope. Cell cycle analysis indicated that Sphase proportion was increased, as well as S/G2 phase was apparently arrested. Bcl2 protein expression was dramatically decreased (P0.01) whereas the expression of Bax and caspase3 was increased in A549 cells
5、 after treated by matrine. CONCLUSION: Matrine can exert the significant growthinhibitory effect on A549 cells and induce the cell apoptosis, which is probably related with the downregulation of Bcl2 expression via changing the permeability of mitochondrial membrane. 【Keywords】 matrine; lung adenoca
6、rcinoma; apoptosis; Bcl2; Bax; caspase3 0 引言 苦参碱作为中药苦参的主要活性成分,临床主要用于镇痛、抑菌、抗病毒以及防治肝纤维化. 近年研究显示,苦参碱具有明显的抗肿瘤作用1-2 . 雷怀定等3研究发现苦参碱对体外人肺癌 A549 细胞具有增殖抑制作用,我们观察苦参碱诱导人肺癌A549 细胞凋亡及其机制,为苦参碱用于临床抗肿瘤提供理论依据. 1 材料和方法 31.1 材料 苦参碱购自宁夏盐池,配制为 20 g/L 的无菌溶液备用. MTT购自 Sigma 公司. 流式细胞术(flow cytometry, FCM)用mAb(FITCconjugated
7、 mouse antihuman Bax monoclonal antibody and IgG1 isotype control, FITCconjugated American Hamster antihuman Bcl2 monoclonal and American Hamster monoclonal IgG isotype control)为美国Caltag 产品. A549 细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所 . 细胞贴壁生长于含 100 mL/L 小牛血清(杭州四季青生物工程公司)的RPMI 1640(Gibcol BRL 公司)完全培养基中,用含 2.5 g/L 胰酶的消化
8、液进行传代,置 37, 50 mL/L CO2 孵箱中培养. 实验时选用对数生长期细胞. 1.2 方法 1.2.1 细胞增殖活性检测采用 MTT 比色法,将细胞密度调整为 1108/L,接种于 96 孔培养板(Costar) ,每孔 100 L,实验组分别加入不同浓度(30, 60, 120, 240 mg/L)苦参碱, 对照组加入等体积 PBS,另设培养液对照组,每组 4 个复孔,饱和湿度条件下,37, 50 mL/L CO2 培养箱中培养 ,分别于 24, 48, 72 h 加入 MTT 10 L/孔. 继续培养 4 h,每孔加入 100 mL/L 的 SDS 100 L 终止培养,37过
9、夜,用酶联免疫检测仪测定 570 nm 波长处 A 值,计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度(IC50). 细胞经 240 mg/L MATRINE作用 48 h 后用 2.5 g/L 胰酶消化,收集细胞悬液离心(900 4r/min) 5 min,30 g/L 冷戊二醛固定 48 h,10 g/L 四氧化锇染色,经梯度脱水,Epon812 包埋,超薄切片,铀铅双染子显微镜(JEM1230 ,日本电子公司)观察细胞超微结构,美国 Gatan 公司 CCD 采集系统照相4 . 1.2.2 细胞周期分析 MATRINE 作用 24,48 h 后,收集 A549细胞,PBS 洗涤,700 mL/L 冷乙
10、醇固定,PI 染色,FCM(Coulter EPICS XL)检测细胞周期时相的分布. 1.2.3 流式细胞术分析 A549 细胞经苦参碱作用 12, 24 h,收集 1106 个细胞,PBS 洗涤. 加入 FITC 标记的鼠抗人 Bcl2 mAb, 鼠抗人 Bax mAb 及鼠 IgG1 同型对照后, FCM 分别检测 Bcl2, Bax 及 caspase3 蛋白的阳性表达率和平均荧光强度5. 统计学处理: 数据以 xs 表示,应用 SPSS 10.0 统计软件包行方差分析. 显著性检验水平为 a=0.01. 2 结果 2.1 苦参碱抑制 A549 细胞增殖作用 A549 细胞经苦参碱作用
11、 24, 48, 72 h 后,代谢 MTT 的能力明显降低,显示较强的细胞毒性反应,且呈剂量 效应、时间 效应依赖关系(r24 h=0.745, r48 h=0.976,r72 h=0.963, P0.01,表 1) ,24, 48, 72 h 的 IC50 分别为 108.20, 41.28 和 20.67 mg/L. 根据 A570值计算药物处理组细胞存活率(fu)将中效方程 f a/fu=(D/ IC50)m两边取对数,得 log (f a /fu)=log(D/ IC50)m=mlogD-mlog IC50. 设 b=m, a=-mlog IC50, Y=log (f a/fu),
12、X=logD,则 log IC50=-5a/b 以药物浓度的对数为因变量,细胞抑制率与存活率之比的对数为应变量,作出一回归方程 Y=bX+a. 利用该方程求出中效浓度IC50 用回归方程求 IC50.表 1 苦参碱对 A549 细胞增殖的抑制作用(略 ) 2.2 苦参碱诱导的 A549 细胞凋亡作用经相同浓度苦参碱分别处理 A549 细胞 12, 24 及 48 h 后, 电镜下观察到线粒体肿胀及内质网扩张等现象, 核内出现染色质凝集并边集、 核碎裂等凋亡的形态学改变(图 1) . 2.3 苦参碱对 A549 细胞周期分布的影响经 60 mg/L, 120 mg/L 的苦参碱作用,24 h 后
13、 S 期细胞所占比例为 32.3%, 24.0%,48 h 后为 42.8%, 57.0%,与对照组(23.0%, 31.9%)比较均增加(P0.01 ),且随浓度增高而增多 , 以 120 mg/L 苦参碱作用 48 h 时增加幅度较大,为同期生长的对照细胞的 2 倍,G2/M期细胞减少显著,提示细胞发生 S/G2 期阻滞 (图 2). 2.4 苦参碱 对 A549 细胞 Bcl2, Bax 及 Caspase3 蛋白表达的影响 Bcl2 蛋白表达在不同浓度苦参碱处理组及不同时间均较对照组降低(P0.01,表 2) ,有显著性差异(可重复实验双因素方差分析) ,高剂量苦参碱组降低 Bcl2
14、蛋白的作用大于低剂量苦参碱组, Bcl2 蛋白下调以 120 mg/L 苦参碱作用 24 h 时最明显,为对照组的 3.2 倍. 苦参碱作用前后 Bax 的表达水平明显升高. Caspase3 活性呈剂量依赖性升高. 表 2 苦参碱对 A549 细胞蛋白表达的影响(略) 63 讨论 探讨调控肿瘤细胞凋亡的分子机制是目前肿瘤学研究的重要课题,以药物诱导肿瘤细胞凋亡也被用于新的抗肿瘤药物的筛选. 苦参碱是一类研究和应用历史比较长的药物,但其抗肿瘤的作用还处于研究阶段. 我们通过苦参碱对人肺腺癌 A549 细胞的增殖抑制实验发现:苦参碱抑制细胞增长的作用具有周期性,可使细胞发生 S 期阻滞;苦参碱可
15、诱导细胞发生凋亡 . 因此我们就其凋亡途径进行了进一步研究,结果表明,苦参碱下调 Bcl2 蛋白的表达水平.A,B 分别为作用 24,48 h 后的对照组的细胞分布; C,D 分别为 60 mg/L, 120 mg/L 苦参碱作用 24 h 后的细胞分布;E,F 分别为 60 mg/L, 120 mg/L 苦参碱作用 48 h 后的细胞分布 . Bcl2 家族的成员包括:Bcl2/Bax, Bclxl/Bclxs, Bak 等,它们相互作用,参与细胞凋亡的调控,其中以 Bcl2/Bax 的作用尤为重要6. Bcl2 蛋白是抗凋亡的因素,它能抑制许多因素引起的细胞凋亡. Bax 过量表达则抑制
16、Bcl2 功能而促进细胞凋亡7-8. 体内 Bcl2 和 Bax 以二聚体形式发挥作用,若 Bcl2 同聚体形成则细胞存活,而当 Bcl2 与 Bax 形成异二聚体时则抑制 Bcl2的抗凋亡功能,因此认为 Bcl2 与 Bax 之间的比值决定了细胞是否接受诱导凋亡的信号,决定着接受凋亡刺激后的生死. Bcl2 家族诱导细胞凋亡的机制还有: 作用于 PTP 相关蛋白,阻止 PTP 开放,维持 ;抑制 Ros 诱导细胞凋亡. 通过趋化 Caspase 至细胞内的膜结构上(可能就是线粒体膜)来阻断凋亡9. 药物所致7的 Bcl2 蛋白的水平降低可引起线粒体内膜通透性的改变及随后的线粒体的释放反应(细胞色素 C 由线粒体膜间隙进入胞质) 10 ,细胞色素 C 能与 Apaf1 和 Caspase9 形成一个复合体,在dATP