《芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1芽孢杆菌外毒素保护性抗原与上游强启动子穿梭载体的构建关键词：炭疽芽孢杆菌;穿梭载体; 重组;基因 摘要: 目的构建携带炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA ）的两种穿梭载体与上游强启动子。方法将解淀粉芽孢杆菌的 -淀粉酶启动子克隆到载体 pbluescript-sk（+）上，构建载体 pBLKSP;以 A16R疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株）DNA 为模板，设计合成内外侧引物巢式 PCR 扩增获得保护性抗原（PA ）的全基因，先克隆到载体pBLKSP，再将其和质粒 PUB110 重组构建成两种穿梭载体。结果酶切鉴定显示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构
2、建了带有强启动子的两种穿梭载体。为在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和炭疽芽孢杆菌的分子疫苗研究奠定了基础。 关键词: 炭疽芽孢杆菌;穿梭载体; 重组 ;基因 Constructionofshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter. 2Abstract:ObjectiveToconstructtwoshuttlevectorofanthraxtoxinprotectiveantigenwithupstreamstrongpromoter.Meth-odsThepromoterregionofthe-am
3、ylasegeneofBacillusamyloliquefacienswasclonedintopbluescript-sk（ +）vector;thean-thraxtoxinprotectiveantigenwholegenewasamplifiedbynestedPCRfromA16vaccinestraintemplate.FirstlyitwasclonedintopBLKSPvector，thenrecombinatedwithPUB110vectortoformtwokindsofshuttlevectors.ResultsRestrictionanalysisandDNAse
4、quencingconfirmedthattheclonedgenefragmentsencodedanthraxtoxinprotectiveantigen.ConclusionTwokindsofshuttlevectorshavebeensuccessfullyconstructed.ithassetfoundationforfurtherstudyonthehighlyeffectiveexpressioninnontoxican-thracisstrainandmoleculevaccineresearchofBacillusanthracis. Keywords:Bacillusa
5、nthracis;Shuttlevector;Recombination;Gene 炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）引起的一种兽源性人畜共患的急性传染病，主要通过皮肤接触、呼吸道、消化道等多种方式感染，其死亡率极高。因此，开展炭疽疫苗等预防性研3究在我国还是尤为重要。炭疽芽孢杆菌含有两种能够独立复制的质粒 pXO2 和 pXO1，分别编码细菌荚膜和炭疽毒素1 。质粒pXO1 编码 3 种毒素:保护性抗原（Protectiveanti-gen，PA） 、致死因子（Lethalfactor，LF）和水肿因子（Edemafac-tor，EF）2，3 。保护性抗原 PA 介导
6、 EF/LF 进入细胞内发挥毒性作用但本身并不具有任何毒性，是一种很有效的保护性抗原和免疫原，而且是获 FDA 批准的人用炭疽疫苗 AVA 的主要免疫活性成分。本实验克隆和表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA ）全长基因，以能在芽孢杆菌中自主复制并有穿梭功能的载体 PUB110 为基础，构建了具有强启动子双筛选功能的两种大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭载体 pJB1 和pJB2，为进一步其在无毒炭疽疫苗株中的高效表达和能否作为预防炭疽芽孢杆菌感染的分子疫苗打下了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒 A16R 疫苗株（Tox+，Cap-，弱毒株） ，无毒炭疽疫苗株（pXO1-pXO2-
7、型 Sterne-1 株）由卫生部兰州生物制品研究所惠赠;质粒 Pbluescript-sk（+）由上海生工惠赠;穿梭质粒 PUB110 邮购自美国 ATCC 细胞库;GM2163 （Dam-Dcm- ）由 NEB 北京总代理公司赠送;HB101 感受态细胞购于北京经科宏达有限公司。 41.1.2 酶及主要试剂 TakaRaLATag 酶，TakaRaT4DNA 连接酶，购自北京六合通生物技术有限公司;TOPOTMTACloningKits 购于 invitrogen 公司; 脑心浸液购于北京经科宏达有限公司KpnI、XhoI、SmaI 、BamHI 和 PstI 购于 NEB 公司。 1.2
8、 方法 1.2.1PA 抗原上游强启动子的构建根据文献 4得到解淀粉芽胞杆菌的 -淀粉酶启动子序列:tttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaataaggaataaaggggggttgttattattttactgatatgtaaaatat-35-10aatttgtataa 由上海生工进行全基因合成并将合成好的序列按照相应顺序克隆在质粒 pbluescript-sk（+）的 SmaI 和 PstI 两个多克隆位点上，经测序序列完全正确，将构建的重组质粒重命名为 p
9、BLKSP。 1.2.2 巢式 PCR 扩增 PA 基因在 GENEBANK 中找到炭疽毒素质粒 pXO1 和 PA 抗原基因的全序列（GI:47566322 和GI:10088950） ，分析 PA 基因（包括 RBS 区和信号肽区）在 pXO1质粒中对应的位置，然后应用软件 PrimerPremier5 进行内外侧引5物的设计，选择最优化的组合。 外侧引物:sense5CGTTGGTTAGCTTGGACAGTTGTATG3Anti-sense5TTTAAACGCATAGGATGTGCCATTG3内侧引物:sense5GGCTCGAGAAAGGAGAACGTATATGAAAAAACGAAAA
10、GTG3Anti-sense5CCGGTACCTTACCTTATCCTATCTCATAGCCTTTTTTAG3 1.2.3 穿梭载体的构建用 KpnI 和 XhoI 双酶切扩增的 PA 基因及构建成功的含 -淀粉酶启动子的重组质粒 pBLKSP，纯化双酶切的产物，并将纯化后的 PA 基因及重组质粒 pBLKSP 按摩尔比 1:1加入连接反应体系，T4DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞 HB101，涂板于含氨苄青霉素的 LB 平板上（含 X-gal 和 IPTG） ，37孵育过夜。挑取白色菌落，提取质粒进行 PCR 鉴定，筛选阳性克隆，将构建的重组质粒重命名为 pBLKSPPA。用 Ba
11、mHI 单酶切质粒 PUB110 和构建的重组质粒 pBLKSPPA，纯化单酶切产物加入磷酸酶去磷酸化（防止自连） ，将去磷酸化的 PUB110 和重组质粒pBLKSPPA 在 65水域灭活后按照摩尔比 2:1 进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞 HB101，涂板于含氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的 LB 平板上，37孵育过夜。挑取白色菌落，提取质粒进行6PCR 鉴定，筛选阳性克隆，将构建的两种穿梭质粒重命名为 pJB1和 pJB2（图 1） 。 图 1 穿梭质粒 pJB1 和 pJB2 的构建（略） Fig1ConstructionoftheShuttleVectorpJB1andpJB2 1
12、.2.4 无毒炭疽疫苗株的电转化电转化无毒炭疽疫苗株（PXO1-PXO2-型 sterne-1 株） ，所用基因脉冲转化仪为 Bio-Rad 公司产品。先将重组质粒在 GM2163 中去甲基化5 ，挑取一环无毒炭疽疫苗株接种于 5mlBYGY 培养液（1.9%脑心浸液，0.5%酵母提取物，0.2% 葡萄糖，0.4% 甘油，0.1MTrispH8.0 ）中，37摇床 225rpm 振荡培养 12h 后取 1ml 转至新鲜 BYGY 培养液，至 OD600 在 0.850.95 左右，4，5000g ，离心 5min 后收集其菌体，悬浮于 10%的 1ml 甘油中，加入 10g 在质粒 DNA 混
13、匀后，冰浴 37h，取 0.4ml 混合液置于口径为 0.2cm 的电穿孔杯内，电转化条件为 6.25kv/cm，25F，1000 脉冲作用后，在混合液中加入 4ml 培养基，37振荡培养 3h，再涂在含抗生素的选择培养基平皿上，37倒置培养直至转化子长出。 2 结果 2.1 炭疽芽孢杆菌保护性抗原（ PA）基因的 PCR 扩增 PCR7产物电泳结果证实为单一的 DNA 条带，分子量大小约 2500bp，与预期的 2369bp 结果一致（图 2） 。 图 2 炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因扩增后的琼脂糖凝胶电泳（略） Fig2PCRaplificationproductsofAnthrax
14、ToxinProtectiveAntigengene 1:DNAMarkerDL15000;2:PAgene;3:Neganive 2.2 重组质粒双酶切鉴定根据重组质粒的序列对其用不同的限制性内切酶切割以鉴定重组片段的大小。结果证实重组质粒含有与目的基因大小相同的插入片段（图 3） 。 图 3 穿梭质粒 pJB1/pJB2 双酶切鉴定及 PCR 验证（略） Fig3IdentificationofthepJB1/pJB2bydigestionwithrestrictionenzymeandPCRaplification 1:DNAMarkerDL15000;2:pJB1/pJB2digest
15、edbyKpnI;3:pJB1/pJB82digestedbySmaIandKpnI;4:PCRaplificationusingshuttleplasmidpJB1/pJB2 2.3pJB1/pJB2 穿梭功能验证 PUB110 是一个金黄色葡萄球菌/ 芽孢杆菌穿梭质粒，要检测融合后的新质粒是否仍具有穿梭功能，需将 pJB1/pJB2 质粒转化到无毒炭疽疫苗株（pXO1-pXO2-型Sterne-1 株）中加以验证。电转化后，将平皿中长出的转化子接种在含有 1010-6g/ml 卡那霉素的培养基中，37下静置培养，经 5000r/min 离心收集菌体，提取无毒炭疽疫苗株总 DNA。电泳检查可
16、见，无毒炭疽疫苗株基因组 DNA 以及 pJB1 和 pJB2 质粒DNA 带（图 4） 。 图 4 从无毒炭疽疫苗株和大肠杆菌中提取的穿梭质粒pJB1/pJB2 质粒电泳图谱（略） Fig4ShuttleplasmidpJB1/pJB2extractedfromnontoxicAnthraxvaccinestrainandE.coli 1:ChromosomeofnontoxicAnthraxvaccinestrain;2:pJB1/pJB2ex-tractedfromnontoxicAnthraxvaccinestrain;3:pJB1/pJB2extractedfromE.coli;4:HindIIIdigestDNAMarker93 讨论 目前，被批准生产的炭疽疫苗主要有两大类:炭疽减毒活疫苗和 PA 组分疫苗，但两者都具有局限性。减毒活疫苗会引起严重的全身反应，未能在正常人群中推广应用。美国批准的人用疫苗（AV
