《耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用 （9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用 【摘要】 目的 探讨耐多药结核病（MDR-TB）临床分离株rPOB、KatG 和 rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP ）技术分析了 54株同时耐异烟肼（INH） 、利福平（RFP） 、链霉素（ SM）的多耐药临床分离株和 45株药物敏感株的 rPOB、KatG、rpsL 基因突变。结果 以结核分支杆菌 H37RV为对照，45 株药物敏感株的rPOB、rpsL 基因 SSCP图谱正常，其特异性为 100%；KatG 基因有 2株图谱异常，特异性为 95.6%。89 株结核分支杆菌临床
2、分离株均未发现 rPOB、KatG 、rpsL 基因缺失，其 PCR扩增产物 SSCP分析结果表明：54 株多耐药临床分离株中， 49株 rPOB基因图谱异常；32 株 KatG基因图谱异常；40 株 rpsL基因图谱异常。其敏感性分别为 rPOB(90.7%)、KatG(59.3%)，rpsL(74.1%)。结论 结核分支杆菌耐 RFP、INH、SM 耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG 和 rpsL基因突变所致。PCR-SSCP 技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。【关键词】 结核分支杆菌；rPOB 基因； KatG基因；rpsL 基因；SSCP；药物耐受性2Studies
3、of Mycobacterium tuberculosis multi-drug resistant gene【Abstract】 Objective To evaluat the importance of rPOB、KatG and rpsL gene mutation detection in multi-drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Methods rPOB、KatG and rpsL gene mutation of 54multi-drug resistant clinical iso
4、lates，which is INH RFP and Sm resistance and 54 drug susceptible strains were analyzed using polymerase chain reaction-single strand conformation (PCR-SSCP).Results SSCP pattern of H37RV strain as control，SSCP pattern of rPOB，rpsL PCR amplification from drug susceptible strains were all the same as
5、control. The specificity was 100%. However，the different SSCP pattern of KatG gene were found in 2 susceptible strains. The specificity was 96.3%. Gene deletion of rPOB、KatG and rpsL were not found in all clinical isolates tested. SSCP patterns of rPOB gene were different from control in 49 drug res
6、istant clinical isolates. SSCP patterns of KatG gene were different from control in 32drug resistant clinical isolates，SSCP pattern of 3rpsL gene were different from control in 40 drug resistant clinical isolates. The sensitivity were 90.1% (rPOB)，59.3% (KatG) and rpsl (74.1%)，respectively. Conclusi
7、on The major mechanism of RFP，INH，SM resistant drug was rPOB、KatG and rpsL gene mutation，respectively PCR-SSCP may be one of the way which applied to drug resistant detection of Mycobacterium tuberculosis.【Key words】 Mycobacterium tuberculosis；rPOB gene；KatG gene； rpsL gene；SSCP；drug tolerance我国是结核病
8、疫情最严重的国家之一，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。近年来随着分子生物学的研究进展人们对抗结核分枝杆菌的药理作用位点和结核分枝杆菌耐药机制，尤其是耐异烟肼、利福平和链霉素。目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法。但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆菌生长更为缓慢，其耐药性测定需 68 周甚至更长，不能及时指导临床用药。新进开展的 Bactec法药敏检测因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛使用。4据报道1INH 耐药与过氧化氢酶- 过氧化物酶的编码基因（KatG）有
9、关、而某些结核分支杆菌耐 SM的产生是由于其核糖体蛋白 S12编码基因（rpsL）和 16SrRNA编码基因（ rrs）突变所致2 ，同时也证实了结核分支杆菌耐利福平与 RNA聚合酶的 亚基的编码基因 rPOB的突变有关3 。笔者采 PCR-SSCP银染法对54例（同时耐 INH、RFP、SM）和 45例（药物敏感）肺结核病人痰标本临床分离株同时进行 KatG基因、rPOB 基因和 rpsL基因突变分析。1 材料与方法1.1 菌株来源 H37RV标准株来源于中国药品生物制品检定所，45例敏感株和 54例同时耐 INH、RFP、SM 的临床分离株来自珠海市人民医院、沈阳市胸科医院等。按结核病诊断
10、细菌学规程进行菌种鉴定及药敏试验证实为结核分支杆菌，耐药株则同时对异烟肼、利福平、链霉素耐药。药物的最高浓度为异烟肼 10mg/L、利福平250mg/L、链霉素 100mg/L。1.2 方法51.2.1 细菌 DNA制备 临床分离株 DNA用常规酚/ 氯仿提取，并将纯化后的提取物置于20保存备用。1.2.2 PCR扩增 采用 25l反应体系，4xdNTPs 终浓度为0.2mmol/L，引物终浓度为 0.2mol/L，置 DNA扩增仪扩增，扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳。紫外检测 rPOB出现 258bp条带、KatG出现 282bp条带、rpsL 出现 267bp条带即为扩增阳性。1.2.3
11、SSCP银染 PCR扩增阳性的标本进行 SSCP检测，扩增产物加等量甲酰胺变性液 95变性 10min，立即冰浴 5min，在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，条件为 6、100V 电压，电泳约23h，电泳结束后，取凝胶板行硝酸银染色，观察结果并照相。2 结果(1)PCR扩增以结核分支杆菌 H37RV标准株 DNA为对照。45株药物敏感株和 54株耐多药临床分离株 KatG、rPOB 和 rpsL基因6均扩增成功。(2)45株结核分支杆菌敏感株 rPOB和 rpsL基因 PCR扩增片段SSCP图谱与 H37RV株相比均未发现异常，特异性为 100%。KatG基因扩增片段 SSCP有 2株与 H
12、37RV相比泳动异常，特异性为95.6%。54 株同时耐 INH、RFP 和 SM的临床分离株中，与H37RV相比， KatG基因 32株泳动异常， 22株无改变；rPOB 基因 49株泳动异常，5 株无改变；rpsL 基因 40株泳动异常，14 株无改变，SSCP 检测 KatG基因、rPOB 基因、 rpsL基因的阳性率分别为 59.3%、90.1%和 74.1%。 （见表 1）表 1 结核分支杆菌KatG、rPOB、rpsL 基因扩增及 SSCP结果注：aSSCP 图谱与H37RV有差异 3 讨论笔者采用 PCR-SSCP技术分析了 54株同时耐异烟肼、利福平和链霉素的多耐药临床分离株及
13、 45株临床敏感株的 KatG、rPOB 和rpsL基因突变。结果表明：多耐药临床分离株 SSCP，KatG 突变率为 59.3%，药物敏感株有 4.4%的突变率。rPOB 突变率为790.1%，rpsL 突变率为 74.1%，两者药物敏感株均无改变。表明结核分支杆菌异烟肼耐药与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因 KatG有关，KatG 基因在 INH耐药中起主导作用。最近的研究结果表明，大多数的耐 SM的产生是由于核糖体蛋白 S12编码基因（rpsL）或16SRNA编码基因（ rrs）突变所致。本文有 72.2%的结核分支杆菌耐 SM临床分离株有 SSCP泳动异常，表明其 rpsL基因发生了突
14、变，这与 Morris等的结果相似 2 。由此可见 rpsL基因突变是结核分支杆菌耐 SM临床分离株最常见的基因突变。但有一部分耐 INH株未检测到 KatG缺失或突变，提示某些菌株的耐 INH形成可能与KatG无关。如 inhA基因、ahpC 基因也与 INH耐药有相关性4，5 ，INH 耐药机制尚有待进一步研究。据国内外报道6，7耐 RFP结核分支杆菌 rPOB基因突变的发生率为92.7%97.6%，敏感株无突变。这与本文的结果相近，表明结核分支杆菌耐利福平与 RNA聚合酶的 亚基的编码基因 rPOB有关，rPOB突变已成为结核分支杆菌耐 RFP的主要遗传指标。在耐INH、RFP 和 SM
15、结核分支杆菌中，有 60%左右同时有 INH、RFP和 SM遗传标志改变，20%30%有 2种耐药遗传标志改变，10%20%只有 rPOB点突变。说明 75%以上耐多药分离株是各种药物靶分子的编码基因突变所致。同时有报道69095%的耐利福平株也同时耐异烟肼，这样单独进行利福平的药物敏感性分析即可初步判定细菌的耐药谱，因而可作为耐多药的筛选指标。8【参考文献】1 Roues DA，Li ZM，Bai GH，et al.Characterization of the KatG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of M
16、.tuberculosis.Chemother，1995，39：2472.2 Morris S，Bai GH，Suffys P，et al.Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.JID，1995，171：954.3 Williams D，Waguespack C，Eisenack K，et al. Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother，1994，38：2380-2386.4 Baneriee A，Dubnau A，Quemard V，et al.InhA，a gene encoding a target for isoniazid and ethiona
