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1、1考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量作者：王多宁赵雁武田芙蓉 【关键词】蛋白质测定 关键词: 蛋白质测定;考马斯亮蓝; 微盘比色法 摘要: 目的建立快速、灵敏的测定蛋白质的方法.方法以考马斯亮蓝作为显色剂，用酶联免疫测定仪微盘比色测定牛血清白蛋白和小鼠肝组织匀浆的蛋白含量，并与常量比色法进行了比较.结果考马斯亮蓝微盘比色法与常量法相比，对样品的测定结果相近，而前者样品用量少（只需几微升） ，简便、快速、检测极限低（0.63g）.结论考马斯亮蓝微盘比色法是一种简单、快速、灵敏的蛋白质测定方法，尤其适用于大批量、微量样品的蛋白质含量测定. Keywords:proteinassay;coomass
2、iebrilliantblue;mi-croplate-colormetric Abstract:AIMTodeveloparapidandsensitivemethodofproteinquantificationassay.METHODSProteincontentofbovineserumalbumin（BSA）andmiceliverhomogenatewasdeterminatedbymicroplatecolor2metric（MPC）inwhichcoomassiebrilliantblue （CBB）isusedascolorreagent.RESULTSDetectingli
3、mitofMPCwaslower（0.63g ）thanthatofmacro-colormetric（MC）.MPChadadvantageofrapidityandlesservolumeofsample（afewmicroliter ）.CONCLUSIONMPCisamethodofsimplicity，rapidityandsensitivityforproteinquantificationassayespeciallysuitableforthedeterminationoflargenumberofmicrolitersamples. 0 引言 生物样品蛋白质含量的测定是许多实
4、验室经常遇到的问题.常用的方法有 Lowry 氏法和 Bradford 法1-4 （也称考马斯亮蓝法）.考马斯亮蓝（CBB）法由于方法简单，显色剂单一，反应迅速等更被常用.但对于大批量而蛋白质含量又少的样品测定，常量法（MC）测定比较费时、费试剂，且 CBB 与蛋白质结合物易吸附在比色杯上，不易清洗，重复使用会影响测定结果.因此，我们建立了酶联免疫检测仪微盘比色测定法（MPC）. 1 材料和方法 1.1 材料牛血清白蛋白（ BSA） ，上海长阳生化制药厂产品.考3马斯亮蓝 G-250，Fluka 进口分装.其他试剂均为分析纯试剂 .DG3022A 型酶联免疫检测仪，南京华东电子管厂产品.721
5、 分光光度计，上海第三分析仪器厂产品. 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制标准牛血清白蛋白液:蛋白浓度为 0.5gL-1，以生理盐水配制.考马斯亮蓝显色液:CBB-G-250100mg 溶解在50mL 的 950mLL-1 的乙醇中，然后加 850gL-1 磷酸 100mL，放置至室温后加蒸馏水稀释至 1L，用滤纸过滤避光保存备用 . 1.2.2 标准曲线的制作常量法:在试管中分别加入蛋白标准液:12.5，25，50，75 ， 100，125，150L（即含 BSA 分别为6.25，12.5，25，37.5，50，62.5，75g ） ，然后分别加生理盐水补充使其体积为 200L，空白管加
6、200L 生理盐水，混匀后各加考马斯亮蓝显色液 4000L，摇匀，室温放置 5min 后，在 595nm 比色测光密度.微量法: 在 96 孔板中分别加入 BSA 标准液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25，7.50L（含 BSA 分别为0.625，1.250，1.875，2.500，3.125 ，3.750g） ，再用生理盐水补充使每孔液体体积为 10L，空白孔只加生理盐水 10L，慢慢摇匀后，分别各加 CBB 显色液 200L 摇匀，室温放置 5min 后，在酶联免疫测定仪 600nm 直接测定吸光度.将各自测定的结果作直线回归，并作图.1.2.3 样品蛋白质含量的测定称取小鼠
7、肝组织，用生4理盐水制成 5gL-1 的匀浆.如有块状不溶物，会造成加样误差，应先以 500rmin-1 离心 5min，然后取上清液测定 . 常量法测定: 在试管中加组织匀浆 100L 和生理盐水100L，混匀后，加 CBB 显色液 4000L，摇匀室温放置 5min 后，595nm 比色测定. 微盘比色测定:在 96 孔板中加组织匀浆 5L，生理盐水5L，混匀后加 CBB 显色液 200L，室温放置 5min 后，600nm进行微盘比色测定. 将所测结果分别用各自的回归方程计算出每毫升匀浆的蛋白含量，并作配对 t 检验. 2 结果和讨论 两种测定方法的标准曲线如 Fig1，2.在各自的检测
8、浓度范围内，微盘比色法的线性较好（r=0.9958）. 图 1图 2 略 配对 t 检验的统计结果表明，常量法和微盘比色法比较，t=1.2724， P=0.217，n=24，测定结果相近，无明显差异. 而考马斯亮蓝酶联免疫测定仪微盘比色法，较常量法相比具有简便，快速，灵敏（常量法检出限为 6g，而微盘法的检出限为 0.63g） ，样品5用量少（只需几微升） ，节省试剂，结果打印，线性好等特点，是生物实验室大批量微量蛋白质相对含量测定的首选方法，值得推广. 参考文献: 1BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitionofmicrogramq
9、uantitiesofproteinutilizingtheprincipleofpro-teindyebindingJ .AnalBiochem，1976;72（1-2）:248-254. 2LiHB，LiZR，WangZL，SunLY.Determinationsofproteinbymicro-lowrymethodJ.ShengwuhuaxueYuShengwuwuliJinzhan（ProgBiochemBiophys） ，1993;20 （5）:402-403. 3YeQL，LiWZ ，YangLL，LinDX，LinS，ChenY，LuiJC ，LinAZ.TheCBB-SDSmethodforquantitativemicro-analysisofproteinJ.LinchuangJianyanZazhi（JClinLabTech） ，1986;4（3）:120-121. 4GuoML，JiangYM.Effectofingredientsofcoomassiebrilliantbluecolor-developinregentonproteinJ.ShengwuhuaxueYuShengwuwuliJinzhan（ProgBiochemBioph6ys） ，1996;23 （6）:558-561.
