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1、1结核杆菌 PEPCK 免疫作用的初步研究作者：柏雪莲 王志强 刁兴华 张 珍 刘春会 郭立东 【摘要 】 目的 初步研究结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶（PEPCK）的免疫作用。方法 用敲除 pckA 基因的卡介苗（BCGpckA）和野生型卡介苗（BCGWT ）分别感染小鼠，取肺脏进行病理分析；取脾脏用流式细胞仪检测 CD4+ 、CD8+T 细胞、CD4+/CD8+，酶联免疫吸附试验检测 IL12；取脾脏进行结核杆菌的培养，比较两组菌落数量。结果 BCGpckA 感染的小鼠比BCGWT 感染的小鼠肺脏内产生的结核结节少且不典型，炎性程度低；BCGWT 感染的小鼠脾脏内的 CD4+T 细胞和 C
2、D4+/CD8+及 IL12 滴度明显高于 BCGpckA 感染的小鼠；BCGpckA 株形成菌落的数量明显低于 BCGWT 株形成菌落的数量。结论 pckA基因为结核杆菌生长所必需，其编码产物 PEPCK 能够刺激机体产生免疫反应，可能是一种很好的疫苗候选分子。 【关键词】 结核杆菌； pckA 基因；磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶；免疫保护 【Abstract】 Objective To research the immune effect of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) of mycobacterium tuberculosis.Meth
3、ods Mice were infected with wild type BCG and pckA mutated BCG respectively. The 2lung histology of infected mice was checked.The number of CD4+ and CD8+ T cells，CD4+/CD8+ were assayed by flow cytometry.Interleukin12 was detected by ELISA. BCG from spleens of two groups of mice was cultured and the
4、number of CFU was taken count.Results Granulomas in pckA mutated BCG (BCGpckA) infected mice were fewer and more atypical than those in mice infected with wild type (BCGWT). The number of CD4+ T cells and the ratio of CD4+/CD8+ from the BCGWT group were significantly higher than those form BCGpckA g
5、roup. The titer of interleukin12 of BCGWT infected mice was higher that that of BCGpckA group. And the number of BCG CFU from BCGWT group was more than that of BCGpckA group.Conclusion pckA gene is necessary for the growth of mycobacterium tuberculosis. PEPCK can effectively induce immune responses
6、and can be a good candidate for vaccine. 【Key words】 mycobacterium tuberculosis, pckA gene, phosphoenolpyruvate carboxykinase, immune protection 结核病是由结核杆菌感染所致的慢性传染病。世界上约有 1/3的人感染结核1 。现在使用的预防结核的卡介苗，保护作用从0%80%不等，很不稳定。另外，现在由于药物的应用，多种药物抗性结核分枝杆菌已产生。所以寻找既可作为抗结核的疫苗，又可3作为抗结核药靶的候选分子是当今研究的热点。基因组分析发现，结核杆菌含有 pc
7、kA 基因，其编码 72 kD 的磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK） ，催化草酰乙酸和磷酸烯醇型丙酮酸之间的可逆性反应。PEPCK 在结核致病和诱导机体免疫中可能起重要作用。本研究用敲除 pckA 基因的牛结核菌 BCG 感染小鼠，观察引起肺的病理变化和对淋巴细胞、细胞因子产生的影响，并检测了 BCG 在体内的生长情况；初步研究了结核杆菌 pckA 基因编码的 PEPCK 对结核杆菌生长的重要性及其免疫保护作用，为进一步研究提供了依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器 RPMI 1640 培养液购于 SCIENCE
8、生物公司，HE 和耐酸染剂购于上海市试剂工贸有限公司。检测细胞因子的单抗为美国 BD PMG 公司产品，碱性磷酸酶标记的兔抗大鼠 IgG结合物为美国 Sigma 公司产品。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠 IgG2a、藻红蛋白（PE）标记的 IgG2a 及两者的同型对照为美国BD 公司产品。FC500 型流式细胞仪购于美国BECKMANCOULTER 公司，旋转薄片切片机为上海申安医药器械公司产品。 1.2 菌株 野生型牛结核杆菌（ BCGWT）及敲除 pckA 基因的牛结核杆菌（BCGpckA）由美国哈佛大学公共卫生学院提供。 1.3 实验动物 BALB/c 小鼠，体质量 1822 g,
9、购于山东大学医学院实验动物中心。 41.4 实验方法 1.4.1 BCGWT 和 BCGpckA 感染小鼠：选雌性 BALB/c 小鼠。将 BCGWT 和 BCGpckA 培养至 OD600 为 0.8，用含 0.01%吐温 80 的 PBS 洗涤、混匀。将细菌浓度调整到 1107 个/ml, 每只小鼠尾静脉注射 0.1 ml 菌液, 即 1106 个细菌。PBS 吐温 80 对照组每只小鼠尾静脉注射 0.1 ml。间隔一定的时间处死小鼠，取脾脏，研成 1 mm 大小的碎块，在 1 ml PBST 中搅碎混匀。用 PBS 将悬液稀释，取 100 l 铺板并计算 BCG 的菌落数。用于测定 T
10、细胞时，小鼠每 2 周感染 1 次，共感染 3 次。 1.4.2 组织学检查：取小鼠左侧肺，用 10%PBS 福尔马林浸泡24 h。用乙醇逐级脱水，石蜡包埋。用旋转薄片切片机对包埋块的三个断面进行切片，厚度为 100 m, 用 HE 和耐酸染剂进行染色，显微镜下进行观察。 1.4.3 淋巴细胞的检测：将第 3 次感染后 14 d 的小鼠，无菌取脾，在含有 RPMI 1640 培养液的平皿中，用针栓平端轻微挤压研磨，收集细胞悬液，然后加红细胞裂解液，离心，将沉淀重悬于RPMI 1640 培养液中，计数并将浓度调致 5106/ml ，用流式细胞仪（滨州医学院附属医院中心实验室）进行测定。 1.4.
11、4 细胞因子的检测：将以上收集的脾细胞悬液浓度调致 6.4 107/ml 。将该细胞悬液分别滴入 96 孔无菌细胞培养板中，每孔0.2 ml，培养 3 d 后，收集上清。取培养液上清包被 96 孔反应板，常规 ELISA 法检测。 51.5 统计学方法 采用 SPSS10.0 统计分析软件进行分析。 2 结果 2.1 pckA 基因缺失所致的病理变化 病理学研究发现，在BCGWT 和 BCGpckA 株感染 6 h 后肺脏没有明显的组织学上的变化。在感染后 20 d，肺脏检查显示，BCGWT 感染的小鼠出现清楚的结核结节，结节中含有巨噬细胞、上皮样细胞、中性白细胞和淋巴细胞，有周围小血管和周围
12、小淋巴管积聚。而 BCGpckA 感染鼠体内的结节不如野生型 BCG 感染鼠典型，并且数量少，炎性程度低（图 1） 。 2.2 pckA 基因对淋巴细胞增殖的影响 用 BCGpckA、BCGWT 分别感染小鼠， PBS 吐温 80 做对照，第三次感染 2 周后，取小鼠脾脏，用流式细胞仪检测 T 细胞，结果见表 1。表 1 小鼠脾脏淋巴细胞检测结 2.3 pckA 基因对细胞因子的影响 用 BCGpckA、BCGWT 分别感染小鼠，PBS 吐温 80 做对照，第三次感染 2 周后，取小鼠脾脏进行培养，取培养液上清，用 ELISA 法检测细胞因子 IL12，结果见表 2。表 2 小鼠脾细胞培养上清
13、中 IL12 细胞因子检测结果注：与对照组比较，* P 0.05 2.4 用 BCGWT 株和 BCGpckA 株感染 BALB/c 小鼠，取脾脏进行结核杆菌的培养，结果显示，由第 14 天开始，BCGpckA株形成菌落的数量明显低于 BCG 野生型株形成菌落的数量（P 0.01，表 3） 。 6表 3 每毫升脾细胞悬液培养菌落数对数结果（xs）组别 4 d10 d20 d35 d56 dBCGWT4.90.215.30.194.70.254.80.174.60.15BCGpckA4.70.155.10.164.40.224.20.234.20.25 3 讨论 结核是由结核杆菌引起的对人类健康
14、威胁很大的一种慢性疾病。由于以往所用的卡介苗对人类的保护作用很不稳定，所以现在人们需要寻找新的更好的抗结核疫苗或药物的靶点。本研究用 BCGWT感染的小鼠肺脏内产生明显的结核结节，而用 BCGpckA 感染的小鼠体内产生的结节不典型且数量少，炎性程度低。结核结节是结核杆菌感染的主要特征性免疫病理变化，是机体产生有效保护性免疫反应的表现。结核结节的结构最内层为被包裹的结核菌，再外层为中性粒细胞、类上皮细胞、淋巴细胞，最外层为纤维母细胞形成的纤维层。结核结节的形成把结核菌包裹起来，对于防止其扩散起到很重要的作用。由此可知，pckA 基因编码的 PEPCK 能够有效的刺激机体产生结核结节，对机体产生
15、保护作用。结核杆菌寄生在巨噬细胞内，是引起机体产生细胞免疫反应的主要病原体。本实验中用 BCGWT 感染后，小鼠 CD4+T 细胞、CD4+/CD8+均明显的高于用 BCGpckA 感染的小鼠，即 pckA 基因产物能够刺激 CD4+T 细胞增多、活化。CD4+T 细胞是介导细胞免疫反应的主要细胞，也被认为是抗结核感染的主要细胞2，3 ，尤其是 Th1 细胞在抗结核的免疫反应中起到很重要的作用。有人检7测发现结核感染时 CD4+T 细胞向肺部聚集4，5 。 CD4+T 细胞的增多表明细胞免疫的增强,对结核杆菌的杀伤作用增强。本研究中用 BCGWT 感染的小鼠体内产生的 IL12 明显高于 BC
16、GpckA 组。IL12 在抗结核的免疫反应中起到很重要的作用，IL12 能够诱导IFN 的产生，抑制 IL4 的产生，调节 1 型细胞因子和 2 型细胞因子之间的平衡，这对于幼稚性 T 细胞向 Th1 分化是十分重要的6 。IL12 也是 NK 细胞和 T 细胞的激活剂，尤其对 NK 细胞激活作用显著。乳铁蛋白能够通过提高 IL12/ IL10 的比率增加IL12 的产生 。Feng 等研究发现 IL12 p40 缺陷的小鼠在开始时表现出抑制结核菌的生长，延长生存天数，但最后不可避免的感染上结核，这表明 IL12 的产生对于维持肺内 Th1 细胞的数量是必需的，阻断 IL12 的产生会造成疾病复发。人类如果IL12 基因缺陷也表现出对散在 BCG 的易感性 。本研究还取分别用 BCGWT 和 BCGpckA 感
