《结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究 》由会员分享，可在线阅读，更多相关《结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究 （22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1结核分枝杆菌 Mtb8.4DNA 疫苗构建及免疫保护研究 关键词：结核分枝杆菌;DNA 疫苗;分泌蛋白;细胞免疫; 免疫保护 摘要: 目的评价构建结核菌 DNA 疫苗 pVS84 免疫小鼠体外产生细胞因子的能力和抵抗结核分枝杆菌 H37Rv 攻击的效果。方法利用基因技术将结核菌 Mtb8.4 插入 pVAXl 载体，构建表达结核菌Mtb8.4 蛋白（分泌型）的 DNA 疫苗 pVS84。将雌性 C57BL/6 小鼠分成 5 组，每组 20 只，分别用 pVS84、pVAXl、plL2S 和 PBS分别各免疫 3 次，每次均间隔 2 周，以等剂量加强免疫 2 次。另一组用 BCG（ 105CF
2、U）皮内注射免疫 1 次。每组 10 只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，检测上清细胞因子。另 10 只鼠则用结核菌 H37Rv 经静脉攻击，2 周后取脾、肝和肺培养结核菌并进行菌落计数。结果 pVS84 免疫组鼠脾淋巴细胞培养上清的 mIL-2和 mlFN-Y 平均含量分别为（290.0112.9 ）pg/ml 和（501.779.4）pg/ml ，显著高于 3 个阴性对照组（P0.05） 。5 个组的平均 mIL-6和 mIL-10 无显著性差异。 pVS84 免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌载量分别为（39176.93702.6 ） 、 （ 18780.12535.8）和（2441
3、0.31846.8） CFU/g，分别低于 pVAXl、plL2S 和 PBS 三个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P0.001 ） ，仅脾结核菌2载量显著高于 BCG 免疫对照组。结论构建的 DNA 疫苗 pVS84 能够刺激机体产生抗结核菌所需的 Thl 型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv 攻击的能力与 BCG 接近。 关键词: 结核分枝杆菌;DNA 疫苗; 分泌蛋白;细胞免疫; 免疫保护 ConstructionandprotectiveefficacyoftheTBDNAvaccineexpressingMycobacteriumtuberculosissecretoryMtb8.4p
4、rotein. Abstract:ObjectiveToevaluatethecapacityinproductionofcytokinesinvitroandtheprotectiveefficacyofthemiceimmu-nizedwiththeTBDNAvaccinepVS84weconstructed.MethodsPlasmidpVS84expressingsecretoryproteinofMycobacteriumtuberculosisMtb8.4wasconstructedbyinsertingmtb8.4intothevectorpVAX1.20femaleC57BL/
5、6inbredmicein5groupsimmu-nizedwiththe100ugpVS84，pIL2S，pVAX1，PBSandBCG（105CFU） for3timeswith2weeksintervalsexceptBCG（onlyonevac-cinizationwithoutboost）.Seraandsupernatantsof10miceineachgroupweredeterminedforhIL-2，mIL-2，mIFN- ，mIL-6andmIL-310bysandwichELISA.Theother10miceineachgroupwerechallengedwith1
6、06CFUsMtuberculosisH37RvandkilledforculturingH37Rvfromthespleens，lungsandlivers.ResultsTheaverageconcentrationsofmIL-2andmIFN-inthesupe-matantsfrompVS84immunizedmicewere290.0+112.9pg/mLand501.7+79.4pg/mLrespectively，significantlyhigherthanthosefromthepVAX1，pIL2S，andPBSinjectedcontrols（P0.001）.Nosign
7、ificantlydifferencehasbeenobservedforthemiL-6andmiL-10concentrationsfromthemiceinall5groups.TheaverageMtuberculosisloadsinthespleens，liversandlungsinthepVS84immunizedgroupwere39176.93702.6CFU/g，18780.12535.8CFU/gand24410.31846.8CFU/grespectively.Theaveragebacterialloadsofthe3organsinthepVS84immunize
8、dgroupweresignificantlylowerthanthoseoftheircounterpartsinpVAX1，pIL2SandPBSinjectedgroups，butbacterialloadinthespleenswassignificantlyhigherthanthatoftheircounterpartsintheBCGimmunizedcontrols.ConclusionTBDNAvaccinepVS84weconstructedcaninduceThlimmuneresponsewhichisneces-saryforpreventionagainstTB，a
9、nditcanevokeprotectiveimmunitytoH37RvchallengeintheimmunizedmiceequaltoBCGimmu-nization. 4Keywords:Mycobacteriumtuberculosis;TBDNAvaccine;CMI;Protectiveefficacy 结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，结核菌）是引起结核病（TB）的病原体，在全球范围内，TB 每年引起的病死病例为 200 万，每年新出现的结核病例高达 800 万1 。AIDS 在世界范围内的蔓延和耐药性结核病例和多耐药结核病例的增加，使有效控制
10、 TB 的工作更加困难。卡介苗（BCG）在预防儿童结核病成效已得到肯定，但预防成人 TB 则效果不稳定。经严格设计控制的调查结果表明，BCG 的保护率在 080%之间2 。为此寻求优效的新型疫苗乃当务之急。不少学者尝试亚单位疫苗和 DNA 疫苗在结核病的预防工作中发挥更加有效的作用。从目前的结果看，效果仍然欠缺3 。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白 Mtb8.4 的基因连接、插入美国 FDA 推荐可用于人体的表达载体 pVAXl 中，构建表达结核菌保护抗原 Mtb8.4 的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系 C57BL/6 小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌 H3
11、7Rv 攻击的能力显著增强，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 51.1.1 结核菌 H37Rv 标准株（ATCC27294）由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。细菌的增殖在改良罗氏（Lowenstein-JensenMedium，L-J）培养基进行。 1.1.2pVAXl 真核表达载体美国 Invitrogen 公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料（WWW.invitro-） 。 1.1.3 大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）DH5 及 JM109 株本院检验科保存菌株。 1.1.4Ex
12、TaqDNA 酶，LATaqDNA 多聚酶，10PCR 缓冲液，dNTPs，限制内切酶 Kpn，Hind ，BamH和 Nhe等购自大连宝生物公司。 1.1.5PCR 试剂等 PCR 产物回收试剂盒， DNA 连接试剂盒，DNAMarker 等购自大连宝生物公司。 1.1.6BCG 上海生物制品研究所生产。 1.1.7C57BL/6 小鼠购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时 68 周龄，初次免疫时 8-10 周龄。动物在实验期间，6饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的 C57BL/6 小鼠的核心种群来源于 CharlesRiverLaboratories（Wilmington，Mas
13、s，USA） 。1.1.8hlL-2、鼠白细胞介素-2（murineinterleukin-2，mIL-2） 、鼠白细胞介素-6（ mIL-6） 、鼠白细胞介素-10 （mIL-10）和鼠干扰素 （murineInterferon，mlFN-）定量测定试剂盒由法国DiacloneResearch 公司产品。 1.1.9 胎牛血清（CSF）购自暨南大学生物技术研究所，为进口分装产品。 1.1.10RPMI1640 培养基 Gibco 公司产品。临用前，10mlCSF 与 90mlRPMI 培养液混合即可。 1.1.11 免疫读数仪芬兰 Labsystem 公司生产的WellscanMK型。 1.
14、2 方法 1.2.1 结核菌基因组 DNA 的提取用接种环从 L-J 斜面上刮取少许 H37Rv 菌落，放入尖底塑料离心管管底，加入溶菌酶和蛋白酶K 裂解菌体后，苯酚氯仿纯化，无水乙醇沉淀 DNA 后，加入7100lTE 缓冲液溶解备用4 。 1.2.2 表达载体的构建过程:见图 1。 1）合成引物:hIL-2 信号序列 DNA 片段的制作:hIL2sig-P1:5-CCGCATGCTAGCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTATGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCAAAGCTTCAG-3。hIL2sig-P2:3-GGCGTACGATCGTAC
15、ATGTCCTACGTTGAGGACAGAACGTAACGTGATTCAGAACGTGAACAGTGTTTGTCACGTTTCGAAGTC-5。以上两条单链核酸分别为 hIL-2 信号序列互补的正链和负链，见hIL-2 基因:Genbankaccessionnmber:NM-000586 。信号序列（Signal-peptide:295354 位碱基序列， 60bp，20aa ）;成熟肽链（Mat-peptide:355-753 位寡核苷酸链，399bp，133aa ）6，7 。下划线部分分别为 Nhe 和 Hind酶切位点。 2）根据 DNA 序列，合成单链小片段 DNA，再通过 PCR 方
16、法，把单链小片段 DNA 拼接成一条完整的双链叫 A 片段。 3）上述合成的片断经 Nhe和 Hind双切酶，产物通过PCRFragmentRecoveryKit 回收，命名为 hIL-2s。 84）将 pVAX1 质粒 DNA 经 Nhe和 Hind 双酶切，并回收目的片段。 5）设计合成扩增 Mtb8.4 基因引物:Mtb8.4-P1:5-ATATAAGCTTGCCGCCGCCATGAGGCTGTCGTTGACCGCA-3（40mer） 。下划线部分为 Hind酶切位点。斜体部分GCCGCCGCC 为 Kozak 序列，该序列位于启始密码子前有利于抗原的高效表达。含有起始密码子 ATG。Mtb8.4-P2:5-GCGGGTACCCTAGAATTCATAGTTGTTGCAGGAGCCGGC-3（39mer） 。下划线部分为 Kpn酶切位点
