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1、1结核分枝杆菌 Ag85B作者：师长宏，范雄林，柏银兰，薛莹，张海，徐志凯 【关键词】 ,分支杆菌 【Abstract】 AIM: To evaluate humoral and cellmediated immune response by Ag85B and ESAT6 fusion proteins and to test their protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis (MTB) challenge. METHODS: BALB/c mice were immunized three times at a 2we
2、ek interval subcutaneously on the mouse back respectively with fusion protein Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B that were transferred to membrane beforehand. The spleen lymphocytes of the immunized mice stimulation index (SI) were measured by MTT method and the level of secreted IFNwhich upon antigenspecifi
3、c stimulation was detected by ELISA. The fusion proteins vaccinated BALB/c mice were intravenously infected with 105 CFU MTB H37Rv. Four weeks later the numbers of CFU in spleens were determined. RESULTS: The titer of sera specific antibody in BALB/c mice immunized with fused expression protein Ag85
4、BESAT6 was 11000 and that of ESAT6Ag85B was 15000. The SI of fusion proteins 2immunized groups was significantly higher (which was 2.400.17 and 2.600.25 for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively) than that of saline immunized group (0.900.21). The IFNlevels in culture supernatant o
5、f spleen lymphocytes from the fusion proteins immunized mice were (3.510.30) g/L and (4.050.41) g/L for Ag85BESAT6 and ESAT6Ag85B immunized groups respectively, significant different from those of saline immunized group (0.500.25) g/L, P0.05, which were lower than that of Bacillus Calmette Guerin (B
6、CG) immunized group (5.550.31) g/L. Compared with the saline immunized mice（bacteria load was 6.310.13） dramatic reductions of MTB replication were observed in the spleen (bacteria load was 5.040.11 and 5.150.29 respectively, P0.05) of BALB/c mice immunized with fusion proteins following a subsequen
7、t challenge, but the protection efficacy of the mice immunized with Ag85BESAT6 or ESAT6Ag85B was higher than that of BCG vaccination group. CONCLUSION: Ag85B and ESAT6 fusion protein can be used as novel components of the new TB vaccine. 【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis ; vaccines； Ag85B； ESAT6
8、； recombinant fusion proteins 3【摘要】 目的： 研究 Ag85B 与 ESAT6 融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对 MTB 感染小鼠的保护力. 方法：采用皮下包埋的方法，将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3 次，每次间隔 2 wk，用 MTB 培养上清滤液蛋白（ culture filtrate proteins, CFP）作为抗原，ELASA 测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答，最后一次免疫完成后 4 wk，取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞，体外用抗原刺激，MTT 法检测淋巴细胞刺激反应，E
9、LISA 检测悬液中IFN 水平. 另一部分免疫的 BALB/c 小鼠经尾静脉感染 MTB 毒株H37Rv，4 wk 后计数脾脏细菌负荷数. 结果： Ag85BESAT6 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 11000，ESAT6Ag85B 蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 15000. 融合蛋白 Ag85BESAT6和 ESAT6Ag85B 免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2.400.17 和2.600.25，而生理盐水组只有 0.900.21；相对应的 IFN 含量分别为(3.510.30) g/L 和(4.050.41) g/L，显著高与生理盐水对照组（0.500.25) g/L， P0.
10、05，但不及 BCG 免疫组（5.550.31) g/L. 与生理盐水免疫组（细菌负荷 6.310.13）相比较，融合蛋白免疫的 BALB/c 小鼠，对攻击感染后抗 MTB 在脾脏中增殖有显著作用（细菌负荷分别为 5.040.11 和 5.150.29, P0.05） ，但与 BCG 免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微. 结论： Ag85B 与 ESAT6 融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分. 【关键词】 分支杆菌，结核；疫苗；抗原 85B；ESAT6 ；重4组融合蛋白质类 0 引言 包含免疫优势蛋白 Ag85B 和早期分泌蛋白 ESAT6 的重组亚单位疫苗所提供的保护效力与曾经接触过环境分枝杆
11、菌无关，这个发现证实亚单位疫苗不受致敏作用的影响而能刺激保护性 T 细胞应答，从而使得这种疫苗可能在 BCG 免疫无效的地区应用1. 亚单位疫苗在小鼠中证实有效，可产生与 BCG 相同的免疫效果. 为了全面评估我们表达的 Ag85B 与 ESAT6 融合蛋白的免疫学特性2 ，我们研究了两种融合蛋白 Ag85BESAT6 和 ESAT6Ag85B 在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答水平，同时测定免疫小鼠对 MTB 毒株 H37Rv 攻击的保护力. 1 材料和方法 1.1 材料 MTB H37Rv 毒株： 由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠. BCG 疫苗株： 陕西省生物制品研究所出品 .
12、 鼠IFNELISA 检测试剂盒（ GENEZYME 公司） ，潮霉素（GIBCO BRL公司）. 7H9 液体培养基，BCG 培养增强剂（albumindextrosecatalase, ADC）和 RPMI1640 培养基均购自GIBCO 公司. MTB 的 CFP 由本室制备. 羊抗鼠 IgGHRP 购自华美生物公司. 68 周龄 BALB/c 小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于该中心 P3 级感染实验室. 1.2 方法 51.2.1MTB 毒株 H37Rv 的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB 毒株 H37Rv 接种到 7H9 培养基（含 100 g/L ADC 和
13、0.5 g/L Tween80） ，37振摇培养 3 wk，5000 r/min 离心 10 min，收集细菌，保存于-20 备用 . 用 7H9 液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基 37培养 2 wk，计数浓缩液细菌的 CFU. 1.2.2BCG 的培养和定量取 BCG 疫苗株接种到 7H9 液体培养基（含 100 g/L ADC 和 0.5 g/L Tween 80） ，相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的 CFU. 1.2.3 融合蛋白的大量制备和转膜取 AZpProEX HTEF 和EZpProEX HTAF 阳性克隆 2 ，活化后分别接种到 1000 mL LB培养液中，3
14、7振摇培养至对数生长期，IPTG 诱导，集菌，先进行SDSPAGE，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，剪下表达位置的条带. 1.2.4 免疫动物分组实验共分 4 组，每组 10 只小鼠. 一组用Ag85BESAT6 融合蛋白转膜条带免疫 BALB/c 小鼠；一组用ESAT6Ag85B 融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠. 两组免疫剂量均为 10份条带/只，包埋于小鼠腹股沟处皮下，共免疫 3 次，每次间隔 2 wk，收集小鼠血清，用 CFP 作为抗原，ELASA 测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度,同时设 BCG 和生理盐水对照组. 最后一次免疫结束后 4 wk，进行以下实验： 每组取 5 只小鼠，用于
15、测定淋巴细胞 SI和 IFN 水平；其余 5 只用于毒株攻击实验. 1.2.5 脾脏淋巴细胞的分离与制备将免疫的小鼠断颈处死，无6菌取脾脏，置于平皿内 200 目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入 RPMI1640 培养液冲洗 . 将上述细胞悬液转入 2 倍体积的淋巴细胞分离液，1000 r/min 离心 20 min. 吸取中间单核细胞层，用RPIM1640 液洗涤两次后计数 . 1.2.6 特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5108/ L，在 96 孔板中用 100 mL/L FCS 的 RPMI1640 完全培养液培养，200 L/孔，同时实验组每孔加入 25 L MTB
16、CFP（25 mg/L 溶于 PBS，本室制备） ，对照组不加 CFP，调零孔不加脾细胞，37 50 mL/L CO2 孵箱培养 68 h 后，每孔加 20 L MTT（5 g/L，溶于 PBS，pH 7.2，过滤除菌） ，继续培养 4 h 后弃上清，加DMSO 150 L/孔，振荡 10 min，测定 A490 nm 值. 结果用刺激指数 SI=A（实验组）/A（对照组）表示. 1.2.7IFN 的诱生及含量的测定 5109/ L 脾细胞在 24 孔板用含 10 mL/L FCS 的 RPMI1640 完全培养液中培养，800 L/孔，同时加入 MTB CFP 100 L/孔，37 50 mL/L CO2 孵箱培养 72 h，收集培养液，5000 r/min 离心 5 min，取上清，-20冻存备检. 参照试剂盒说明（夹心 ELISA 法）测定各标本所含 IFN 浓度. 1.2.8
