《白藜芦醇体外抑制人胰腺癌细胞增殖的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白藜芦醇体外抑制人胰腺癌细胞增殖的实验研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1白藜芦醇体外抑制人胰腺癌细胞增殖的实验研究【摘要 】 目的:探讨白藜芦醇(resveratrol，Res) 体外对胰腺癌MIAPaCa-2 细胞增殖的影响，并探讨其初步机制。方法:采用四甲基氮唑蓝法（MTT ）检测 Res 处理后 MIAPaCa-2 细胞的增殖情况。用倒置显微镜、透射电镜观察 Res 处理后细胞形态学改变，用流式细胞仪分析经 25molL-1、50molL-1、100molL-1、200molL-1 Res 分别作用 48 h 后 MIAPaCa-2 细胞凋亡率。结果:Res 体外能明显抑制 MIAPaCa-2 细胞的生长增殖，且在一定范围内呈时间、浓度依赖性。经 Res
2、处理后，倒置显微镜观察到细胞数目减少，部分细胞变圆，核浓缩，提示可能存在细胞凋亡；电镜证实存在典型的细胞凋亡形态学改变。用 25molL-1、50molL-1、100molL-1、200molL-1 Res 处理 48 h 后，流式细胞仪检测出各处理组的细胞凋亡率明显高于对照组(P0.05)。结论:Res 在体外能明显抑制 MIAPaCa-2 细胞的增殖，诱导细胞调亡可能是 Res 抑制 MIAPaCa-2 细胞增殖的主要机制之一。 【关键词】 白藜芦醇 胰腺癌 增殖 凋亡Abstract: Objective:To explore the effect of resveratrol(Res)
3、 2on the proliferation of pancreatic carcinoma MIAPaCa-2 cells in vitro and explore the rudimental mechanism. Methods: Methyl thiazolyl tetrazolium method (MTT) was used to detect the cell growth status of MIAPaCa-2 cells after treatment with Res. The morphologic changes of cells after treatment wit
4、h Res were detected by inverted microscope and transmission electron microscope. The apoptosis rates were analyzed with flowcytometry(FCM) after the cells were treated with 25molL-1, 50molL-1, 100molL-1 and 200molL-1 Res for 48 h, respectively. Results: Res inhibited the proliferation of MIAPaCa-2 c
5、ells in a concentration-and time-dependent manner as measured by MTT method. After the cells were treated with Res, inverted microscope observed the reduction of the cell number and found significant morphologic changes, characterized by cell rounding and cell nuclear enrichment suggesting apoptosis
6、. And the presence of typical morphological changes of apoptosis was confirmed with transmission electron microscope. The apoptosis rates at 25molL-1, 50molL-1, 100molL-1 and 200molL-1 Res-treated groups after treatment for 48 h, measured by FCM, were significantly higher than those in control group
7、s(P99.9%，用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，配成 400molL-1 贮存液，消毒后，分装，于-20 冻存备用。噻唑蓝(MTT) 和 DMSO均为美国 Amresco 公司产品，处理细胞时，DMSO 浓度0.1%(实验证实该浓度对细胞生长无影响)。DMEM 培养基(Dulbecco modified Eagle medium)、0.25%胰酶为美国 GIBCO 公司产品，碘化丙啶(propidium iodine，PI)为美国 Sigma 公司产品。1.2 细胞培养 人胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞在 5%CO2，37 条件下，用含 10%小牛血清
8、、1% L-谷氨酰胺、100 Uml-1 青霉素、100gml-1 链霉素的 DMEM 培养液传代培养，培养至 70%80%融合时，用 0.25%胰酶消化传代继续培养。1.3 MTT 法检测 Res 处理后 MIAPaCa-2 细胞的增殖抑制率 胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用 0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1105/ml，重新接种到 96 孔培养板上，约 1104/孔，于 37 过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约 70%融合。然后，将细胞分Res 处理组、溶剂对照组及空白对照组：Res 组分别换用含不同浓度 Res(25molL-1、 50molL-1、100molL-1、200mo
9、lL-1)的培养液 100l；溶剂对照组换用 100l 含与 Res 相应浓度 DMSO的培养液；含 100l 培养液( 不含细胞与药物 )孔板作为空白对照组。5每组设 3 复孔。分别培养 12 h、24 h、48 h、72 h 后，加入MTT(5 mgml-1)20l/孔，继续培养 4 h 后，去上清，加入 DMSO 100l/孔，室温振荡 10 min，上酶标免疫测定仪检测，492 nm 波长测定吸光度值(absorbance，A)。比色时，空白组调零。计算细胞增殖抑制率，抑制率=(1-处理组 A/溶剂对照组 A)100%。绘制不同时间浓度-抑制率曲线。以上实验重复 3 次。1.4 形态学
10、观察1.4.1 倒置光学显微镜观察：胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用 0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为 1105/ml，重新接种到 96 孔培养板上，为 1104/孔，于 37 过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约70%融合。将细胞分 Res 组和对照组：Res 组分别换用含不同浓度Res(25molL-1、50molL-1 、100molL-1、200molL-1)的培养液 100l，对照组含不加药物培养液 100l。于 5%CO2、37 条件下分别继续培养 48 hr 后，倒置光学显微镜观察细胞形态学改变并摄片。1.4.2 透射电镜观察：胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用 0.25%胰
11、酶消化后，接种到 6 孔培养板上，于 37 过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约 70%融合。将细胞分 Res 组和对照组：Res 组换用含25molL-1、50molL-1、100molL-1、200molL-1 Res 的6培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 条件下分别继续培养 48 h 后，分别收集对照组、Res 处理组的细胞，送湘雅医学院电镜中心检测。1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞用0.25%胰酶消化后，重新接种到 6 孔培养板上，于 37 过夜，使细胞贴壁生长，培养至细胞约 70%融合。将细胞分 Res 组和对照组：Res 组换用含不同
12、浓度 Res(25molL-1、 50molL-1、100molL-1、200molL-1)的培养液，对照组含不加药物培养液。5%CO2、37 条件下分别继续培养 48 h 后，收集对照组、25molL-1、50molL-1、100molL-1、200molL-1 Res 处理组细胞(1106)，加预冷 70%乙醇固定过夜，用 PI 染色。流式细胞仪检测，multicycle 软件分析结果。1.6 统计学处理方法 单处理因素组间多样本均数的多重比较采用单因素方差分析,并用 LSD-t 检验进行样本均数间两两比较；多处理因素采用析因设计的方差分析，并用单因素方差分析和 LSD-t 检验进行样本均
13、数间两两比较，用 SPSS10.0 软件分析结果。2 结果2.1 MTT 比色法检测细胞增殖抑制率 分别用 25molL-1、50molL-1、100molL-1、200molL-1 处理 MIAPaCa-27细胞 12 h、24 h、48 h、72 h 后，酶标仪测定 A 值结果后,计算增殖抑制率，具体结果见图 1。用两因素析因设计方差分析后，结果显示：不同浓度 Res 对胰腺癌 MIAPaCa-2 细胞增殖抑制率不同(F=526.12，P=0.000)；Res 不同作用时间对胰腺癌细胞增殖抑制率不同(F=805.27， P=0.000)。并用单因素方差分析和 LSD-t 检验进行样本均数间两两比较，结果分析示：除 100molL-1 与200molL-1 分别处理 12 h 或 72 h 抑制率差别无统计学意义外，其余各组在同一时间或同一浓度范围内，组间两两差异均有统计学意义(P0.05)。可见 Res 体外对 MIAPaCa-2 细胞有明显抑制作用, 且在一定范围内基本上呈浓度、时间依赖性。2.2 形态学观察2.2.1 倒置光学显微镜：对照组细胞贴壁生长良好，细胞充分生长，透光度好。25molL-1 Res 外理 MIAPaCa-2 细胞
