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1、1液相杂交检测 B 细胞淋巴瘤细胞系 miR-28 的表达【摘要 】 microRNA (miRNA)是一组在进化上高度保守、非编码蛋白、参与转录后调节的小分子 RNA（19-25 核苷酸） 。为了进一步明确 miRNA 的加工机制及功能和定量研究 miRNA 的表达水平，应用液相杂交和 Northern blot 两种方法检测 miR-28 在 B 细胞淋巴瘤细胞系中的表达并进行了比较。结果表明：液相杂交和Northern blot 检测 miR-28 均显出阳性结果，但液相杂交所用的细胞总 RNA 量（5 g）明显少于 Northern blot（30 g） ，液相杂交的条带信号也较 No
2、rthern blot 的强。结论：液相杂交是一种较 Northern blot 更为快速、简便和敏感的检测 miR-28 的方法。 【关键词】 淋巴瘤Expression of miR-28 in B Cell Lymphoma Cell Lines Detected by Solution HybridizationAbstract microRNA (miRNA) is evolutionarily conserved，non-coding small RNA (19-25 nt) involved in post-transcriptional gene regulation.To f
3、urther understand 2the biogenesis and functions of miRNA，and to quantify miRNA expression levels，the expression of miR-28 in B lymphoma cell lines was detected by solution hybridization and Northern blot，and their detected results were compared.The results indicated that detection of miR-28 by solut
4、ion hybridization and Northern blot showed positive，but total RNA amount used for solution hybridization detection was significantly lower than that for Northern blot detection (5 g vs 30 g)，signal of solution hybridization was stronger than that of Northern blot.It is concluded that the solution hy
5、bridization for detection of miR-28 in B cell lymphoma cell lines is a faster and more sensitive method as compared with standard Northern blot technique.Key words solution hybridization; Northern blot; miRNA; lymphoma; miR-28microRNA(miRNA)是一种大小约 19-25 个碱基的单链小分子 RNA，是由具有发夹结构的约 70-90 个碱基大小的单链 RNA 前体
6、经过切酶（dicer ）加工后生成 1 。miRNA 在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，而且在进化上高度保守，在人类3已经发现有 222 个 miRNA。目前对 miRNA 的研究不断深入，并认为这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。由于 miRNA 是一类很小的分子，它的表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用 RT-PCR 的方法来定量研究非常困难，目前研究人员多采用 Northern blot 方法来检测 miRNA 的存在2 。传统的 Northern blot 方法是用探针检测固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相
7、中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，本研究采用液相杂交（solution hybridization）的方法检测 4 种 B 细胞淋巴瘤细胞系中miR-28 的表达。miR-28 基因是 22 个碱基的单链小分子 RNA，是由具有发夹结构的 86 个碱基的单链 RNA 前体经过切酶加工后生成，位于染色体 3q27-28 的含 LIM 的脂肪瘤多见融合伙伴（ LIM-containing lipoma preferred partner，LPP ）基因中。材料和方法细胞系B 细胞淋巴瘤细胞系 HRC57、RCK8、BEVA 和 OCL-LY8，采用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640
8、培养液，于 37、5% CO2 及恒定湿度条件下培养。4细胞总 RNA 的提取总 RNA 提取采用 TRIzoL 试剂（Life technologies 公司）进行 RNA 一步法提取。取对数生长期细胞 1107，经预冷的 PBS 洗涤，移入离心管中，加入 1 ml TRIzoL，混匀，室温静置 15 分钟；加入 0.2 ml 氯仿，振荡 15 秒，静置 3 分钟；4 、 12 000g 离心 15 分钟，取上清；加入 0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10分钟 ；4、12 000g 离心 10 分钟，弃上清；加 1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀；4、 7 500g 离心
9、 5 分离，弃上清；风干，加入适量的 DEPC H2O 溶解；-80 保存备用。RNA 定量取适当稀释的 RNA 样品，分别在紫外分光光度计 260 nm 和 280 nm 波长下读数，按 1 OD 值 40 g/ L RNA 计算 RNA 的含量。miR-28 探针制备5采用 mirVanaTM miRNA Probe Construction Kit（Ambion 公司）制备探针。miR-28 的序列为：5AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 3。设计 miR-28 探针为：在 3端另外增加 8 个和 T7 启动子互补的碱基 5CCTGTCTC 3，将这段寡核苷酸和 T7 启动子引
10、物退火，用 Klenow DNA 聚合酶，于37作用 30 分钟，将大片段补齐得到双链 DNA 转录模版，然后与T7 RNA 聚合酶、rNTP 和标记物（-32PUTP）混合，体外37作用 30 分钟，转录得到标记的小分子 miR-28 探针 5 GAGACAGGCUCAAUAGACUGUGAGCUCCUU 3；DNase 于37，作用 10 分钟消化多余的双链 DNA 转录模版。具体操作参照产品说明书进行。Northern blotRNA 电泳首先制备 15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，在离心管中混合待测细胞系总 RNA （30 g）和加样缓冲液（5 l） ，95-100 变性3 分钟，立即置冰
11、浴，加样，恒流（20 mA）进行电泳，分离分子量大小不同的 RNA。待溴酚蓝移至胶长的 2/3 时中止电泳，紫外灯下观察 RNA 质量。6转膜用半干转移法（semi-dry transfer）将 RNA 从变性胶转移到 Hybond 尼龙膜上（Amersham Biosciences 公司） （200 mA，30 分钟） ，UV 交联。预杂交 将膜的反面紧贴杂交瓶，加入杂交液（Amersham Biosciences 公司）10 ml，42预杂交 3 小时。杂交将变性的同位素标记的 miR-28 探针（95-100 变性 5 分钟，冰浴 5 分钟）20 l 加入到杂交液中， 42杂交 4 小时
12、或过夜。洗膜 倾去杂交液，用 2SSC/0.1%SDS/DEPC 水，42洗 20 分钟，2 次；再用 1SSC/0.1%SDS/DEPC 水，42 洗 20 分钟，2次。显影用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X 光片。7暗盒置-80 放射自显影 2-3 天左右检测结果。液相杂交用 mirVanaTM miRNA Detection Kit（Ambion 公司）进行，首先将同位素标记的 miR-28 小分子探针进行凝胶纯化（ gel purification） ，然后与待检测细胞系总 RNA （5 g）混合，95-100变性 3 分钟后于 42杂交 2 小时或过夜。基于核酶保护分
13、析方法，用单链核酸酶 RNase A/T1 消化未杂交的 RNA 和多余的探针，于 37作用 1 小时。然后用 RNase/PPT 溶液 225 l 使核酸酶失活，并加等量的 100%乙醇，于-20条件下，作用 30 分钟沉淀杂交的 RNA 分子， 4、12 000g 离心 15 分钟，弃上清，风干 10 分钟，与加样缓冲液 5 l 混合，95-100变性 3 分钟，加样于 15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，恒流（20 mA）电泳至待溴酚蓝移至胶长的 2/3 时停止，用薄型塑料纸将凝胶包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X 光片。暗盒置-80放射自显影 1-2 天检测结果。具体操作参照产品说明书进行。
14、结 果细胞总 RNA 提取用本方法所提取的细胞总 RNA 的 D (260)/D (280) 和 D 8(260)/D (230) 都在 2.0 左右，说明 RNA 样品未受到蛋白质、苯酚和碳水化合物的污染。RNA 电泳时 18 S 和 28 S rRNA 的条带清晰，无拖尾现象，说明 RNA 的纯度和完整性都很好。miR-28 探针制备用 mirVanaTM miRNA Probe Construction Kit 制备的探针经 15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影，在 30 个碱基处可见明显清晰的条带，说明探针标记良好。Northern blot 和液相杂交两种方法检测 miR-2
15、8 的结果比较从附图中可以看出：miR-28 在 HRC57、RCK8、BEVA 和OCL-LY8 细胞系中的表达是不一致的。 Northern blot 和液相杂交两种方法均检出阳性结果；液相杂交所用细胞总 RNA 为 5 g，Northern blot 为 30 g，而液相杂交结果条带信号较更强，说明液相杂交检测 miR-28 较 Northern blot 方法敏感。讨 论RNA 一度被认为仅仅是 DNA 和蛋白质之间的“过渡阶段” ，9但越来越多的证据表明，RNA 在生命的进程中扮演的角色远比我们先前设想的更为重要。RNA 干扰（RNA interference）的发现使得人们对 RN
16、A 调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化或替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意。miRNA 是一种大小 19-25 nt 的单链小分子 RNA，最早被确认的 miRNA 是在线虫中的 lin-4 3和 let-71，4 ，到目前为止已经有将近 1 400 个 miRNA 在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中被报道。随着对这些 miRNA 的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面日益深入研究发现，miRNA 发挥着非常重要的基因表达调节作用，可以从一种全新的角度来认识基因及其表达调节的本质。2002 年美国科学杂志评出的年度十大科技突破中，miRNA 的发现名列榜首。近年来，miRNA 在恶性疾病中的作用引起很大的关注，认为miRNA 在肿瘤发病中起重要作用5 。Calin 等6研究发现，50%以上的 miRNA 基因定位于与
