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1、1核酶在基因治疗中的研究进展关键词：核酶；基因治疗 摘要：80 年代初，由美国科学家 Cech 和 Altman 发现了核酶（Ribozyme）,随着人类基因工程研究的深入，部分临床实验室工作者和基础科学研究人员开始注意到 Ribozym 在基因治疗中的应用潜力。近几年来，人们利用 Ribozyme 可以特异性地切割靶 RNA序列的特点，设计适合的 Ribozyme 阻断特定基因的表达，相继对艾滋病、肿瘤、生殖系统疾病、肝炎、白血病、移植排斥反应等疾病进行了大量研究。试验结果表明 Ribozyme 作为基因治疗的一种方法有着广阔的应用前景和极大的临床实用价值。 AdvanceinStudyof
2、GeneTherapybyRibozyme 核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性的 RNA 分子，可特异性地切割靶 RNA 序列。迄今，人们发现的核酶有六种类型，即 1 类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶及 VS 核酶，但从结构上看主要分为两大类1：锤头状核酶和发夹状核酶。锤头状核酶长约 30 个核苷酸，由三个碱基配对的螺2旋区、两个单链区和膨出的核苷酸构成。该酶可分为 3 个部分，中间是以单链形式存在的 13 个保守核苷酸和螺旋 组成的催化核心，两侧的螺旋/为可变序列，共同组成特异性序列，决定核酶的特异性。发夹状核酶切割活性所需最小长度为 50 个核苷酸
3、，其中 15个是必需的。该酶由 4 个螺旋区（H ）和数个环状区（J）组成。螺旋、的主要功能是与靶序列结合，决定核酶切割部位的特异性，螺旋配对碱基及其 3端的未配对碱基均为切割活性所必需。核酶的作用原理为核酶的特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶 RNA，根据这一特性可以人工设计针对某一 RNA 的核酶分子，破坏病毒转录产物而对机体无害，将针对多个位点的核酶序列串连成一个多靶位核酶分子可以大大提高切割效率，达到治疗目的。因为其独特的优点：（1）序列特异性；（ 2）不编码蛋白质，无免疫原性；（3）可以重复使用。使其在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。 基因治疗是目前分子水平
4、研究领域中的一个热点，即将具有正常功能的基因置换或增补患者体内缺陷的基因,从而达到治疗目的。经过国内外科学家十余年的努力，基因治疗已从实验室研究阶段过渡到临床试用阶段，其治疗范围已从过去的单基因疾病扩大至多基因疾病，治疗病种涉及面广，目前成为临床治疗一种很有潜力的新方法。 1核酶在抗 HIV 中的研究进展 HIV 可分为 HIV-1 和 HIV-2，至少可以编码 9 种蛋白，研究3者从不同角度选择合适的靶基因。HIV 的PBS（Primerbindingsite）是一个 18 核苷酸序列和 tRNA 的 3末端互补。实验分析展示这段序列是一段高度保守序列，Amer 等2针对这段序列设计了锤头状
5、核酶，抑制了 HIV-1 在体内的复制，5端引导序列是一个诱导区域，对所有 HIVRNA 的转录和翻译都十分重要。通常在此位置剪切产生 5片段，可竞争抑制 HIV 的复制和转录。Weersinghe 等3 以此为靶位点，设计了不同的核酶，使 HIV-1 的表达下降达 95%。Phylactou 等4在 位点设计剪切位点，此位点是 HIV 的包装序列，使 P24 表达水平下降80%90%。Westaway 等5 设计锤头状核酶剪切 U5 破坏 HIV的翻译，U5 区是连接 mRNA 帽状结构的起始区，此实验取得理想的结果。Wang 等6相继报道了抗 HIV-1 新的核酶靶位点：nef开放读码框，
6、细胞内的研究结果表明，核酶可在逆转录开始和原病毒 DNA 整合前发挥有效作用。因此认为 nef 开放读码框是核酶抗HIV-1 感染的新的有效靶位点。 HIV-1tat 基因是反式激活基因，对HIV 的复制至关重要，Konopka 等7针对 tat 基因的编码区设计锤头状核酶 RZ2,将其克隆到逆转录病毒载体中，转染到人外周血T 淋巴细胞，检测 RZ2 的活性，实验证明此核酶有效抑制 HIV-1B 的复制。 为提高核酶的切割效率，对设计合成后的核酶可采用体外修饰，通常对 2-OH进行修饰。实验证明其体外活性可提高 6 倍，稳定性提高 2 倍。据报道国外一些实验室已设计出第二代核酶，针对4靶 RN
7、A 分子的不同位点进行破坏，大大提高核酶的剪切效率。Chen 等设计了 9 位点核酶， Sun 等设计了 3 位点核酶抑制 HIV-1的转录。Alessandro 等8在前体 RNA 被剪切和转运到细胞质之前，设计特异性的核酶并将其插入剪接体 U1 小核RNA（SnRNA ）中，其衍生物和反向 mRNA5端剪切位点互补，在人类 T 细胞系中测试该核酶的活性。结果显示该核酶抑制 HIV-1在细胞内的转录，并使 P24 表达水平大大降低。Koizumi 等9 设计了三种核酶，一个发夹状核酶 HR112，两个锤头状核酶RZ115 和 RZ119，分别导入 CEM 细胞系中，特异性地切割 HIV-1R
8、NA 长末端重复序列（Longterminalrepeat ，LTR ）的 U5 区，结果显示此三种核酶具有抗 HIV-1B 的作用，且 HR112 和RZ119 有极强的抗 HIV-1 感染作用。 2核酶在抗生殖道感染的研究进展 尖锐湿疣（Condyiomaaccuminatum）又称生殖道疣，是一种由人乳头瘤病毒（HPV）引起的性传播疾病。近 30 年来，其发病率持续增高，已鉴定的 HPV 有 70 多型，其中与尖锐湿疣最为相关的是 HPV6、11 型，其 HPV 早期基因组（E1、 E2、 E4、E5、 E6 和 E7 基因）的转录是 HPV 在宿主细胞中增殖的关键步骤。转录的主要调节系
9、统在于上游调控区（LCR）中，调控蛋白是 E2 蛋白，为 4548KD，以二聚体形式结合于 DNA，全长 E2 蛋白是一个典型的反式激活蛋白，它能以二聚体的活性形式特异的结合于上游调控区的 E2 结合位点 ACCN6GGT，可使 HPV5早期基因组的转录水平提高 20100 倍。此外 E1 是 HPVDNA 的复制蛋白，复制结构功能域位于蛋白的末端，E1 功能的实现是通过与上游调控区（URR）中的复制起点（0rigin,Ori）内跨越 nt1 位，长 18bp 的一段反向重复结构结合后发挥 ATP 酶依赖的 DNA 解旋酶作用而开始从 ori 起始整个 HPV 基因组 DNA 复制的。E6 基
10、因能与抑癌基因 p53 的产物及细胞内的 E6 相关蛋白（E6-AP）结合而导致 p53 基因降解失活，E7 蛋白与 Rb 抑癌基因的结合影响 Rb 与细胞转录因子 E2F 结合，使 E2F 与 Rb 分离而影响 Rb 表达。Huang 等针对 HPV6a6b、11E1mRNA 的 3端和 E2mRNA 的 5端（两个起始密码子 AUG 之间的区域）中的保守序列，分别设计合成具有反义抑制和切割活性的锤头状核酶，进行体外切割实验，筛选出具有高效切割活性的 23 种核酶，分别合成 Ribozyme 的基因串联后形成多功能 Ribozyme 基因，并合成只具有反义作用的反义基因作对照。 宫颈瘤是常见
11、的人类生殖道肿瘤，研究证实宫颈瘤组织及其细胞系中，一般都有 HPVE6/E7 基因的高水平表达， HPVE6/E7 蛋白可通过其 N-端 38 个氨基酸与肿瘤抑制基因产物 RB 蛋白结合而使其功能失活，导致细胞周期调控的紊乱和细胞染色体的不稳定。Alvarez 等10针对 HPV16E6/E75端和 3断设计出抗 E6/E7的发夹状核酶 RZ343 和 RZ523 特异性切割 E6、E7RNA 片段，应用启动子 RSV-LTR 提高转录效率，通过钙-磷酸盐共沉淀法将pRSV-RZ523 导入 CV-1 细胞糸中，斑点-印迹杂交法显示此核酶在6CV-1 细胞中高效表达，密度扫描结果显示表达水平约
12、为9.0pmol/106 个细胞，表达的活性核酶的量至少为 50fmol/106 个细胞，细胞连续培养 4 周后，细胞形态无明显改变，说明核酶的长期表达对细胞本身无明显的毒性影响。通过 Rnase 保护测定结果（ResultofRNaseprotectionassay）表明，在 CV-1 细胞中的E7RNA 片段减少 90%，有效抑制 E7 基因的表达。Chen 等11 分别针对核酸位点 123nt、309nt 、671nt 设计三种锤头状核酶切割 HPV-18E6/E7 基因，核酶在靶位点进行杂交，比率为 20：1 ，体外活性切割实验表明，三种核酶均有效抑制 E6/E7 基因转录，其中 RZ
13、309 切割效率最高。Lu 等12设计两种核酶，切割编码HPV-16E6/E7 开放阅读框架（OpenreadingframesORF）的所有转录产物，切割位点为病毒基因链 RNA 上的 110nt 和 558nt，将其插入到腺病毒载体，采用 T7 噬菌体启动子，实验结果显示此两种酶大大降低 HPV-16E6/E7 基因的表达。 3核酶在抗肝炎病毒中的研究进展 我国是肝炎病毒感染的高发区，一直以来肝炎的治疗是临床医生颇为关注的问题。Birikh 等13用一条合成的寡脱氧核苷酸链而来的三个核酶同时进行实验发现，HBVRNA 可被核酶介导切割，从同一 DNA 模板转录的 3 条核酶可同时发挥作用，
14、多核酶的表达将有益于对抗高的病毒目标序列变异。Aoki 等14设计合成了针对 HBVayw 株 P 基因 5端 2360 位点的 RCP，其作用底物为HBVaywP 基因的翻译起始区（ 21402422 区段） ，并将该核酶基7因克隆到表达载体 pSVL 上，利用脂质体介导的 DNA 转染技术，将该核酶的基因引入到 HepG2215 细胞中(HepG2215 细胞系由头尾相接的 HBV 对拷贝基因组转染肝癌细胞系 HepG 而建立的一株能稳定分泌 HBV 各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系 )。实验证明，针对 P 基因 5端的核酶 RCP 对 HbeAg 和 HbcAg 的表达有一定程度抑制作用。
15、Phylactou 等首次使用发夹式核酶，作为抗 HCV 感染的有效治疗物质，阻碍病毒基因组的复制，保护细胞免受 HCV 感染，其设计合成的核酶针对 5-非翻译区（5-UTR ）及编码衣壳蛋白的区域，实验表明针对编码 HCV 衣壳蛋白区域的核酶成为有希望抗HCV 感染的一种治疗途径。Leontis 等15 使用了 5-NCR翻译有关的虫荧光素酶报告基因系统作为敏感的定量研究方法，分别设计出针对核酸位点 136-160，313-317 ，496-520，及对 373-388的四种核酶，证实核酶 1、4 在无细胞环境中均有效。而 2、4 在细胞内有效。推测核酶 1、3 的目标位点可能为双链区，而核
16、酶 2、4目标位点可能为单链区。 Langon 等16针对 HDV 设计合成特异性核酶，切割位点位于基因链 RNA 的 688/689nt 和反基因链 RNA 的903/904nt，其切割活性的最短序列为 84nt,所设计的核酶为复杂的三维结构，通过对反基因链 RNA 核酶 25 个位置进行代偿突变和共突变的实验，发现有 8 对碱基在空间结构上发挥相互作用。 HDV 核酶的研究对肝炎疾病的基因治疗带来了希望。 4核酶在抗白血病中的研究进展 8bcr-abl 融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的p210 蛋白是导致慢粒细胞白血病（Chronicmyoloidleukemia,CML）发生的主要原因。 Daley 等17对 bcl-abc 融合基因 cDNA 序列，在融合位点的上游第-296bp,-1bp 及下游 15bp 处分别设计 3 个相邻的锤头状核酶基因及侧翼序列，用于核酶的相
