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1、高新技术产业发展与科技攻关计划 高新技术产业发展与科技攻关计划科技攻关项目可行性研究报告提纲1.项目概述近年来由于氟喹诺酮类（FQNs）药物在临床及其他领域广泛应用，铜绿假单胞菌（PA）对FQNs类药物耐药日益严重。 研究FQNs的耐药机制，对临床合理用药、延长药物使用寿命及新药的研发有重要意义。 本研究测定了2种FQNs（莫西沙星MXLX，环丙沙星CPLX）对临床分离PA的防耐药突变浓度（MPC）,比较其防突变能力，对不同药物浓度筛选出的耐药突变体用聚合酶链反应（PCR）及DNA测序方法确定其耐药决定簇(QRDRs)的gyrA、parC突变位点和相应的氨基酸变化，采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸精
2、氨酸萘酞胺，PAN)筛选PA MexA-MexB-prM主动外排表型，研究PA MexA-MexB-prM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况,目的探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为优化抗菌药物治疗方案提供参考依据。 2.必要性、可行性和重大意义2.1必要性在抗生素时代，感染仍是人类健康的主要杀手，占全球人口死因的32.7%，其根本原因是耐药致病菌及菌种的不断增加，抗菌药物抑菌活性的逐渐下降。 作为医院感染的重要致病菌，PA对FQNs类药物耐药日益严重。 深入研究FQNs的耐药机制是探求有效的延长抗菌药物使用年限策略、提高难治性感染治疗
3、成功率的有效途径和必要手段。 临床上对于PA感染的治疗策略不应该仅仅着眼于控制感染，在达到控制感染的同时还应该考虑到限制耐药突变株的选择性扩增，通过选择更理想的药物、调整剂量方案、联合用药以关闭或尽量缩小突变选择窗（MSW）,从而减少耐药突变菌株富集扩增的机率,减少耐药。 MPC理论为研究细菌耐药机制开辟了新领域,也对临床应用抗菌药物提出新的要求，不但具有预期的经济价值，亦具有重要的社会效益。 2.2可行性申请者王煜现任中国医科大学附属盛京医院急诊科副主任，副教授，医学博士，一直从事重症感染和病原微生物耐药机制的研究工作。 博士论文获xxScholarship Grantfor YoungFe
4、llows ofDeveloping Countriesfrom theAmerican ThoracicSociety Assemblyon CriticalCare。 论文大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中质粒AmpC内酰胺酶基因型的检测获辽宁省自然科学学术成果贰等奖。 以署名第一作者撰写与本项目有关的论文10余篇（其中1篇被SCI收录，1篇被MEDLINE收录，4篇被BA、CA收录）。 xx年获沈阳市科学技术计划项目一项（1063243-3-00），为第一负责人，现已结题。 参与国家自然基金和省教育厅高等学校科学技术研究项目多项。 项目组成员在硕士和博士研究生期间已熟练掌握了细菌培养、分离鉴定技
5、术，质粒提取及纯化技术，PCR技术，分子克隆技术等分子生物学、生化和化学测定的实验技能。 如获得资助，可立即全方位展开研究工作。 本研究依托于中国医科大学呼吸疾病研究所。 呼吸疾病研究所是国家重点学科，科研人员力量雄厚，曾经承担并正在承担国家级，部级和省级重大科研课题多项。 下属中心实验室仪器设备齐全。 本项目所采用的实验技术和实验设备均不存在任何问题。 2.3重大意义近年来由于FQNs药物在临床及其他领域广泛应用，PA对FQNs类药物耐药日益严重，已成为今天临床抗感染治疗面临的极为严重的问题。 临床上对于PA感染的治疗策略不应该仅仅着眼于控制感染，在达到控制感染的同时还应该考虑到限制耐药突变
6、株的选择性扩增，阻断第一步突变株的富集，减少耐药菌的出现。 本实验不仅从PA的体外试验测定MPC值，对不同药物浓度筛选出的耐药突变株靶位基因突变位点进行测定，而且对PA MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及调控基因mexR突变情况进行检测。 通过对MPC理论的深入研究，将会对临床用药方案和药效与评价产生重大影响，并为解决日益严峻的临床耐药问题提供新的思路和方法。 3.国内外发展现状及趋势，市场需求分析3.1国内外发展现状及趋势在抗生素时代，感染仍是人类健康的主要杀手，其根本原因是耐药致病菌及菌种的不断增加，抗菌药物抑菌活性的逐渐下降。 铜绿假单胞菌(PA)是医院感染的重
7、要致病菌1，近年来随着氟喹诺酮类（FQNs）抗生素的广泛应用,临床分离的PA对其耐药日趋严重。 研究细菌对FQNs类药物的耐药机制，阻断其耐药途径，对指导临床合理用药、延缓新一代FQNs的耐药性及延长其临床使用寿命以及研发新药均有重要意义。 1999年Drlica提出了防耐药突变浓度(mutant preventionconcentration，MPC)和突变选择窗(mutant selection window,MSW)的概念2。 通过对FQNs药物MPC的研究发现,随着琼脂平板中FQNs药物浓度逐渐增加,琼脂平板中细菌恢复生长的菌落数出现两次明显下降。 第一次下降发生在MIC99时,归因于
8、药物抑制了大部分野生型药物敏感菌的生长；随着药物浓度增加,恢复生长的菌落数逐渐减少并维持在相对稳定的水平(平台期),其原因为药物敏感菌株被杀死或抑制,而选择出耐药突变菌株；随着药物浓度进一步增加,菌落数出现第二次明显下降,直至药物浓度增高到某一限度时琼脂平板中没有菌落生长,表明这一浓度阻断了最不敏感的、单步耐药突变菌株的生长,该浓度即为MPC。 MPC提供了抗菌药物治疗中严格限制突变菌株被选择性扩增的抗菌药物浓度阈值，用于评价抗菌药物抑制耐药突变菌株选择的能力。 MIC99与MPC之间的浓度范围为MSW，当治疗药物浓度落在MSW内，敏感菌被抑制或杀灭，耐药突变菌选择性富集，成为主要致病菌，从而
9、产生耐药。 MSW理论与传统的药效学参数MIC有本质的区别3。 MIC的治疗策略着眼于“控制感染”,期望通过抗菌药物杀死或抑制敏感细菌,但有可能使治疗浓度落入MSW,导致耐药突变株的选择性富集。 MPC的治疗策略着眼于“限制耐药变异菌株的选择性富集扩增”,阻断第一步耐药突变从而防止耐药突变株的产生。 MPC和MSW理论为有效抑制细菌耐药及制定抗菌药物应用策略提供了新的思路，为新药的研发提出了新的要求。 PA对FQNs耐药的主要机制是靶位改变和主动外排增强。 PA的靶位改变主要集中在编码DNA促旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶(ParC和ParE)上，对革兰阴性菌,gyrA基因的突变是FQ
10、Ns对PA临床分离株的主要耐药机制,parC基因的突变只是使耐药性上升到更高水平4,5。 环丙沙星（CPLX）单纯抑制DNA促旋酶,而莫西沙星（MXLX）能够同时抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶,所以其耐药性发展缓慢,呈低水平耐药,因为只有在致病菌中的二个靶酶的基因编码同时发生突变时才会导致耐药性的出现6。 PA对FQNs耐药的另一主要机制是主动外排增强。 主动外排系统作用底物广泛，能主动将扩散进细菌细胞的抗菌药物泵出细胞外，使细菌获得耐药性。 现在已确定的MexAB-oprM、MexCD一OprJ、MexEF一OprN、MexXY一oprM、MexGHI一OprM、MexVW一OprM和MexJ
11、K一oprM外排泵与细菌多重耐药有关。 由于MexAB-oprM系统能外排多种临床常用抗生素，如内酰胺类、FQNs、四环素类等，是近来研究最多最有临床意义的外排系统7，8。 MexAB一oprM系统由外膜蛋白oprM、膜融合蛋白MexA和内膜蛋白MexB三部分组成，三种蛋白的表达均受同一基因mexR的调控，mexR的突变可引起该系统的过度表达而使细菌产生耐药。 目前，关于MPC的研究国内刚刚起步，需要建立常用抗菌药治疗各种重要病原菌的MPC,但尚未见对PA的报道。 本研究测定了2种FQNs（MXLX，CPLX）对临床分离PA的MPC,比较其防突变能力，对不同药物浓度筛选出的耐药突变株用PCR及
12、DNA测序方法确定耐其耐其耐药决定簇(QRDRs)的gyrA、parC突变位点和相应的氨基酸变化，采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸精氨酸萘酞胺，PAN)筛选PA MexA-MexB-OprM主动外排表型，研究PA MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况,目的探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为优化抗菌药物治疗方案提供参考依据。 主要参考文献1.I?eri L,Bayraktar MR.Changes in the ratesof antimicrobialresistance amongclinical isolate
13、sof Pseudomonasaeruginosa betweenxxandxxin atertiary-care teachinghospital inTurkey.New Microbiol，xx;31:351-355.2.Drlica K.The mutantselection concentrationand antimicrobialresistance.J AntimicrobChemother,xx;52:11-17.3.Croisier D,Etienne M,Berqoine,etal.Mutant selectionwindow inlevofloxacin andmoxi
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