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1、实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.了解葡聚糖凝胶 SephadexG-25 分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.2、实验原理据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质 12.8 克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的 8 种氨基酸。本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种
2、类及 pH 有关。分子量大的蛋白质( 球蛋白)比分子量小(白蛋白) 易析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。G-25:1000-5000；G-50:1500-30000；G-75:3000-80000三、实验用品仪器：752 型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml 试管 20 支、50ml 烧杯 2 个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶
3、 SephadexG-25饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g ，置于 1000ml 蒸馏水中，在 70-80水温中搅拌溶解。将酸度调节至 pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。四、实验步骤1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离取卵清 2mL 于试管中；加 2mL 的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置 2 分钟；3000r/min,离心 5 分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至 4mL 溶液。取上清液，加入固体硫酸铵（计算 4mL 溶液饱和度由 50%变化为 100%需要加入硫酸铵的克数 1.57g） ；3000r/min，离心 5 分钟；沉淀
4、为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL 溶液。2、 凝胶柱层析（重点讲解，不安排做试验）(1) 凝胶柱的准备：sephadexG-25 沸水溶胀 30 分钟，倾泻法倾去悬浮的小颗粒，湿装法装柱。(2) 加样和洗脱：先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚与凝胶表面相切，用枪吸取 1mL 样液沿着管壁加入柱子上方，再加 3mL 蒸馏水，开始脱盐，每管收集 2mL 共15 管。(3)收集和测定：280nm 紫外吸收测定蛋白质 含量或者用考马斯亮蓝法在在 595nm 波长测吸光度值。(4)以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线，将蛋白质溶液收集待用。（5）将每管的洗脱液取出
5、1ml，加入几滴 BaCl2 溶液，观察是否有沉淀，以此判断脱盐是否完全。5、数据结果与分析（1）数据记录与分析鸡蛋清蛋白 称量项 数据记录与分析离心管质量/g卵球蛋白与离心管质量/g卵球蛋白卵球蛋白质量/g离心管质量/g卵清白蛋白与离心管质量/g卵清白蛋白卵清白蛋白质量/g（2）绘制洗脱曲线0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 600 0.011 0.767 0.468 0.243 0.04 0.057 0.024 0.069 0.017 0.053卵 清 白 蛋 白 的 分 离 和 脱 盐-0.200.20.40.60.810 20 40 60 80体 积A-595系 列 1do
