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1、1-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达及其意义作者：陈胜梅，孙慧，刘延方，张秋堂【摘要 】 为了探讨 -连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达及其意义，应用流式细胞术和免疫组织化学染色两种方法，检测了 20例初治急性白血病患者骨髓细胞 -连环蛋白的表达水平，同时用免疫组织化学染色方法检测了上述细胞的细胞增殖指数 Ki-67 的表达水平。结果表明：与对照组相比，-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达明显升高（P0.05 ） ，并出现由胞浆向胞核转位； Ki-67 在急性白血病骨髓细胞的表达也明显升高（P0.05） ，-连环蛋白的表达与 Ki-67 的表达有明显的正相关(Pearson 相关系数r=0.
2、845)。结论： -连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达明显增高，并与细胞增殖有关，提示 -连环蛋白可能通过促进细胞异常增殖参与急性白血病的发病。 【关键词】 急性白血病Expression and Role of -catenin in Acute Leukemia Bone Marrow Cells2Abstract The aim of this study was to explore the expression of -catenin in acute leukemia bone marrow cells and its role in the development of acut
3、e leukemia. The expression of -catenin of bone marrow cells was detected by immunocytochemistry and flow cytometry in 20 cases of newly diagnosed acute leukemia. Meanwhile the expression of the proliferating index Ki-67 was detected by immunocytochemistry. The results showed that the expression of -
4、catenin and Ki-67 in acute leukemia bone marrow cells was significantly higher than those in control group (P0.05). The migration of -catenin from cytoplasm to nuclear was observed in acute leukemia bone marrow cells. There was a positive correlation between the expressions of -catenin and Ki-67 in
5、all the cases and the Pearson correlation coefficient was 0.845. In conclusion， the expression of -catenin was significantly high in acute leukemia bone marrow cells and showed a positive correlation with the cell proliferation. It suggests that -catenin may be involved in the development of acute l
6、eukemia through promoting the excessive proliferation of cells.3Key words-catenin; the acute leukemia; Ki-67; cell proliferation白血病的发生发展是一个多基因参与、并受多种因素影响的复杂过程。近年来，许多细胞内信号转导分子和基因转录调节因子在白血病发病机制中的作用受到重视。-连环蛋白（-catenin ）是新近发现的一种信号分子，参与多种信号转导，在细胞增生、组织修复、胚胎发育及癌症的发生过程中发挥重要作用1 ；Ki-67 是一种核增殖抗原，出现于除 G0 以外的 G1
7、、S、G2 和 M 期的细胞周期中，是判断细胞增殖活性的一种特异性标志2 。本研究应用流式细胞术和免疫组织化学染色方法检测了急性白血病骨髓细胞中 - catenin 和 Ki-67 的表达，探讨了其在急性白血病发病机制中的意义。材料和方法研究对象及标本处理经细胞形态学、组织化学和细胞免疫学确诊的急性白血病患者 20 例，其中 ALL 患者 8 例，ANLL 患者 12 例。骨髓涂片大致正常的非恶性血液病患者 10 例作为对照。在无菌条件下按照常规操作穿刺，抽取骨髓 1 ml，肝素抗凝，用 0.01 mol/L PBS 11 稀释，4以淋巴细胞分离液（Ficoll，密度 1.077）按常规方法分
8、离骨髓单个核细胞，并调整细胞浓度为 1107/L。流式细胞术检测细胞经 4%多聚甲醛固定 10 分钟，0.1% Triton-X100 通透 10分钟，每个步骤后用 PBS 洗涤 3 次，调整细胞浓度为 1107/L 备用。取 2 支试管，1 管为参照管，加有 PBS；另 1 管为试验管，加有 FITC 结合的 -catenin 单克隆抗体（为美国 Becton Dickinson公司产品，120 稀释） ，各取 100 l 细胞悬液加入 2 管，室温避光孵育 30 分钟，PBS 洗涤 3 次后用流式细胞仪检测骨髓细胞 -catenin 的表达水平。免疫组织细胞化学检测细胞涂片后用 4%多聚甲
9、醛固定 10 分钟，0.1% Triton-X100 通透 10 分钟，用体积分数为 3的过氧化氢溶液室温孵育 10分钟，用羊血清正常封闭，室温孵育 15 分钟，分别加鼠抗人 -catenin 单克隆抗体（北京中山公司产品，150 稀释）和鼠抗人Ki-67 单克隆抗体（美国 Becton Dickison 公司产品，150 稀释） ，置 4过夜，滴加生物素标记羊抗小鼠二抗，37孵育 10 分钟，辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，37孵育 10 分钟，每步之间均用 PBS 洗涤，最后经 DAB 显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每一批实验
10、均设有阳性和阴性对照，阳性对照用胃癌石蜡切片，5阴性对照以 PBS 代替一抗。结果判定流式细胞术在未设门的情况下以 FITC-catenin 为横坐标，细胞数为纵坐标，对骨髓细胞表达 -catenin 的状况进行分析，由于细胞结合抗体的多寡与其荧光强度相关，故以平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示细胞表达 -catenin 蛋白分子的多少。免疫组织化学检测法参照 1997 年全国免疫组织化学技术诊断标准化专题研讨会意见，细胞胞浆胞核着棕黄色者为阳性细胞，根据阳性颗粒所占的比例及显色程度，对阳性细胞进行记分：1 分阳性颗粒所占细胞面积的比例70，细胞
11、浆和/ 或核内见大量深黄色颗粒，浆和（或）核有时可被颗粒掩盖而不显。每片统计 500 个细胞中的6阳性细胞数及总细胞记分，阳性率=阳性细胞数/500100%，平均记分=总细胞记分/500。统计学处理经 SPSS (10.0 版) 统计软件进行统计学分析，统计数据用“均数标准差” （XD）表示，急性白血病组和对照组的比较采用独立样本 t 检验，- catenin 和 Ki-67 的表达相关性分析采用二元变量的相关分析（Pearson 相关系数） 。以 =0.05 为显著性检验水准。结果-catenin 在骨髓单个核细胞的表达免疫组织化学染色方法检测结果 -catenin 在对照组骨髓单个核细胞的
12、表达大部分细胞呈阴性表达，少部分呈弱阳性，仅见胞浆弥散浅黄着色且着色不均匀；在急性白血病患者骨髓单个核细胞中，-catenin 在胞浆和胞核的表达呈强阳性，以胞核表达为主，仅有极少数细胞呈阴性表达，两组间的表达有明显的差异性（P0.05） （表 1，图 1） 。Table 1. Expression of -catenin in acute leukemic cells by immunocytochemical assay（略）7流式细胞术检测结果 考虑到免疫组织化学染色结果主观性较强的因素，我们同时应用流式细胞术检测了 -catenin 的表达，排除参照不同的客观影响后，无论急性白血病组还
13、是对照组，都未能检测到其胞膜的表达，而经过透膜处理后，进一步用抗 -catenin单克隆抗体染色后用流式细胞仪检测，-catenin 在急性白血病骨髓细胞的表达显著高于对照组（P0.05） （表 2，图 2） 。Table 2. Expression of -catenin in acute leukemia bone marrow cells by flow cytometry in MFI（略）Ki-67 在骨髓单个核细胞的表达Ki-67 在急性白血病骨髓单个核细胞的表达与对照组相比有明显的增强（P0.05 ） （表 3） ，但两者阳性细胞的表达强度均显示高低不等。Table 3. Exp
14、ression of Ki-67 in acute leukemic cells by immunocytochemical assay（略）-catenin 与 Ki-67 表达的相关性-catenin 与恶性肿瘤的发生发展有关，Ki-67 反映了细胞的增殖状态，分析 -catenin 与 Ki-67 在急性白血病表达的相关性结果显示两者呈明显的正相关，Pearson 相关系数 r= 0.845。在急性白血病中，-catenin 表达高时，Ki-67 的表达也有增高的趋势（图83） 。讨论-catenin 是一种多功能的蛋白质，具有参与细胞黏附和介导信号转导的双重功能，并与肿瘤的发生发展及浸
15、润密切相关。在正常个体中，-catenin 和钙黏蛋白形成复合体，介导同型细胞的黏附，维持细胞的稳定3 ；同时，-catenin 作为 Wnt/-catenin 信号通路的关键成员在介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡4 。而在恶性肿瘤中， -catenin 的表达呈现明显的异质性，促使细胞异常增殖，还可使细胞之间的黏附性减弱，侵袭性增强5，6 。-catenin 在上皮起源肿瘤中的作用已基本明确，而对其在血液系统恶性疾病中的作用研究并不多见。Chung 等7的研究显示：在白血病细胞系中 -catenin 的表达水平有明显异质性，在 T-ALL、Jurkat、Molt-4、SuDHL4 和 SuDHL5 中 -catenin 高水平表达，而在 HL-60 细胞系中 -catenin 表达水平很低。由于细胞系的特性与活体内白血病细胞已有不同，Jamieson 等8研究了 -catenin 在正常人和 CML 患者（分为慢性期，加速期，急变期）造血干细胞和骨髓前体细胞的表达，结果显示：和慢性期相比，-catenin 在 CML 的加速期和急变期的骨髓细胞核中总表达明显增加。9本研究在前两者的基础上直接以急性白血病病人骨髓白血病细胞为对象，进一步探讨 -catenin 在急性白血病中的作用。在急性白血病的骨髓细胞中，-catenin
