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1、1WT1 基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究作者：胡绍燕， 陈子兴， 赵晔， 岑建农， 谷敏， 傅铮铮， 何军， 顾伟英【摘要 】 本研究探讨 WT1 基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性，为开展基于 WT1 基因调控的白血病基因治疗奠定基础。 以 EGFP 做报告基因，构建含有 WT1 基因启动子和增强子的重组表达载体；利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染 13 个细胞株，包括 WT1 基因高表达的白血病细胞株（K562、NB4、THP1 、SHI1 ） ，WT1 基因低表达的白血病细胞株（U937 和 Jurkat） ；非造血细胞株中 WT1 基因高表达的MCF7、T47
2、D、293 株细胞和 WT1 基因低表达的ECV304、SMMC7721 、HT29 、SHG44 细胞株；利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达 EGFP 的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和（或）增强子的转录活性。结果表明： 通过基因重组技术构建了含有 WT1 基因启动子的表达载体 pEWP，以及含有WT1 基因启动子和增强子的表达载体 pEWPA。就启动子的转录活性而言，在非白血病细胞株中，ECV304 细胞 EGFP 的平均荧光强度最高，是空载体（pEGFP1 ）的 16.542.45 倍，明显高于白血2病细胞株（p0.05） ； MCF7 和 SHG44 细胞次之，分别为9.46
3、1.10 和 7.290.73 倍，HT29 细胞表达最低，仅为0.990.02 倍。在人类血病细胞株中，K562 细胞 EGFP 的平均荧光强度最高，是空载体 pEGFP1 的 2.930.27 倍，明显高于 Jurkat和 SHI1 细胞株（ p0.05） 。后二者分别为 0.740.03 和0.840.09 倍。pEWPA 可以使 HT29、SHI1 和 K562 细胞中WT1 基因启动子的转录活性增强，分别增强到 4.81、3.06 和 1.01倍。结论： WT1 基因启动子的转录活性与细胞内在 WT1 基因的表达水平不相关，增强子增强部分细胞株中 WT1 基因启动子的转录活性，但不具
4、有造血组织特异性。 【关键词】 平均荧光强度Transcriptional Activity of WT1 Gene Promoter and Enhancer in Diverse Cell LinesAbstract The objective of study was to investigate tissuespecific transcriptional activity of WT1 (Wilms tumor gene) promoter and enhancer in cell lines with diverse tissue origin for leukemic gene
5、therapy depending on WT1 transcriptional regulation elements. WT1 promoter and enhancer were ligated into pEGFP1 to construct a 3recombinant vectors with EGFP gene as a reporter. By using electroporation or lipofectamine, the resultant constructs were transfected into 13 cell lines including WT1expr
6、essing hematopoietic cell lines (K562, NB4, THP1 and SHI1), WT1nonexpressing hematopoietic cell lines (U937 and Jurkat), WT1expressing nonhematopoietic cell lines (MCF7, T47D and 293) and WT1nonexpressing nonhematopoietic cell lines (ECV304, SMMC7721, HT29 and SHG44). The mean fluorescence intensity
7、 (MFI) of EGFP representing the transcriptional activities of promoter and/or enhancer was analyzed by using flow cytometry in the transfected cells which stably expressed EGFP. The results indcated that the vectors, pEWP containing WT1 promoter and pEWPA containing both WT1 enhancer and promoter, w
8、ere constructed by recombinant DNA technique. Among nonhematopoietic cell lines, pEWP induced the highest EGFP expression in ECV304 (16.542.45 times as high as pEGFP1), mildly higher in MCF7 and SHG44 (9.461.10 and 7.290.73 times of pEGFP1 level), and lowest in HT29 (0.990.02 times as much as pEGFP1
9、) respectively. Among hematopoietic cell lines, EGFP expression was highest in K562 cell line (2.930.27 times of pEGFP1), which was statistically 4higher than those in Jurkat and SHI1 cell lines (0.740.03 and 0.840.09 times of pEGFP1 level) respectively. pEWPA, with WT1 enhancer inserted at Afl II s
10、ite near SV40 polyA, increased basal transcription levels of the WT1 promoter in HT29, SHI1 and K562 cells by 4.81, 3.06 and 1.01fold respectively. It is concluded that the transcriptional activities of WT1 promoter in the recombinant vector seem unrelated to the constitutional expression level of e
11、ndogenous WT1 gene. The WT1 enhancer promotes the transcriptional activities of WT1 promoter in some of the cell lines regardless of the hematopoietic tissue origin.Key words WT1 gene; WT1 promoter; WT1 enhancer; mean fluorescence intensity; leukemic cell line; hematopoietic tissue specificityWT1(Wi
12、lms tumor susceptibility gene)基因是 1990 年由Call、Bonetta 、Gessler 等在 Wilms瘤中发现并克隆，定位于11 号染色体短臂的 1 区 3 带，是一种对泌尿生殖系统的发育和Wilms 瘤的发生发展有重要意义的基因。近年来的研究发现，WT1 基因参与人类造血调控，在人类多种白血病及实体瘤中均有WT1 基因的异常高表达。由于白血病患者 WT1 基因表达水平高，5与性别、年龄、FAB 分型、乳酸脱氢酶水平及染色体核型等均无关，故被看作是一种”泛白血病”的分子标志1 。目前以 WT1 基因为靶点治疗白血病的研究报道很多，基本上是针对 WT1 基
13、因表达产物的免疫治疗和反义寡核苷酸治疗，尚无基于 WT1 基因启动子和增强子调控的白血病基因治疗。中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)WT1 基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究根据基因表达调控原理，基因特异性的表达是反式作用因子与顺式作用元件共同作用的结果。而作为顺式作用元件，同一基因的启动子和增强子在不同的组织、细胞中可能会有不同的作用。Fraizer 等2和 Zhang 等3利用 CAT 做报告基因，研究 WT1 基因的转录调控元件，发现 WT1 基因的启动子无组织特异性，而增强子具有造血组织特异性。Hosen 等4利用 EGFP 做报告基因，
14、发现 WT1 基因的启动子存在多个转录起始位点，WT1 基因的增强子在造血细胞中具有协同作用。本研究在上述研究的基础上，将转染靶细胞扩大到 13 种属于不同组织来源的细胞株，通过检测 EGFP 的平均荧光强度确证 WT1 基因的启动子和增强子的造血组织特异性，以便开发基于 WT1 基因启动子和增强子调控的白血病基因治疗途径。6材料和方法主要材料携带 WT1 基因启动子和增强子的质粒 pCB.7e250（ ）由美国Fraizer GC 博士惠赠； pEGFP1 载体购自 Becton Dickinson Biosciences 公司。大肠杆菌 DH5 为本实验室保存。琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒
15、为 Qiagen 公司产品；T4 DNA 连接酶和限制性核酸内切酶 Hind、Pst 、BamH I、Sal、Hpa为 MBI 公司产品；Afl和 Stu为 TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为 Promega 公司产品；Klenow 片段为上海华美生物公司产品；PEG8000 为上海生工公司产品；蛋白酶K、 DNA 分子量标准购自 MBI 公司；卡那霉素、Xgal 和 IPTG 为Sigma 公司产品；脂质体为 Invitrogen 公司产品； Epics XL 型流式细胞仪为 Coulter 公司生产；实时定量 PCR 试剂购于 TaKaRa 公司。
16、实时定量 PCR 仪 MJ Research Opticon2TM 为 MJ 公司产品；BDFACS AriaTM 为 Becton Dickinson 公司产品，用于细胞分选。重组载体构建WT1 基因启动子的构建 pCB.7e250（ ）进行 Hind/Pst双酶切，将所得到的 WT1 基因启动子片段克隆到 pUC18 质粒，经测7序证实后再与 Hind/Pst双酶切 pEGFP1 体连接，构建成含有WT1 基因启动子的表达载体，即 pEWP，进行酶切鉴定。WT1 增强子的构建 将 pCB.7e250（ ）进行 BamH酶切，所得到的 WT1 基因增强子片段克隆到 pUC18 质粒，经测序证实后，进行补平，再与经 Afl酶切后补平且去 5磷酸化的 pEWP 连接，构建成含有 WT1 基因启动子和增强子的表达载体，即 pEWPA，进行酶切鉴定，参见文献5 。细胞培
