《Ras┐MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Ras┐MAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1RasMAPK信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用作者：宋立强戚好文郎兵刘飞 【关键词】 ,哮喘 关键词: 哮喘;气道重塑; 信号传递 摘 要:目的 探讨 Ras-MAPK 信号转导系统在哮喘气道重塑中的作用. 方法 以卵蛋白诱导并激发的豚鼠哮喘模型为研究对象，选择末次诱喘后即刻至 240min 间数个时间点，采用 Dot-blot 分子杂交法检测气道 ras mRNA 水平.免疫组化 ABC 法研究气道 Ras 和MAPK 蛋白的表达情况. 结果 与正常对照组相比，哮喘组豚鼠气道上皮水肿、脱落，平滑肌层及基底膜显著增厚.诱喘后 ras mRNA 的表达水平明显上调，30min 达高峰并维持至
2、 120min.各级气道的上皮和平滑肌细胞 Ras 表达量显著增加，而 MAPK 只在气道平滑肌层呈现高表达现象. 结论 Ras-MAPK 信号转导系统在哮喘气道重塑早期发挥重要作用，阻断这一途径有望延缓重塑的病理过程. Keywords:asthma;airway remodeling;signal transduction 2Abstract:AIM To investigate the role of Ras-MAPK signal transduction pathway in the remodeling of airway in asthma.METHODS The asthma
3、models in guinea pigs，which were induced and provoked by ovoglubulin，were used in this study，and then the level of ras mRNA in airway were exam-ined by Dot-blot molecular hybridization at several pointsafter provokation（0 ，30，60，120，240min ）.Immunohis-tochemical techniques were used to observe the e
4、xpressions of Ras and MAPK，respectively.RESULTS Compared with the normal group，asthma animal airway showed edema and drop of epithelium cells，thickening of smooth muscle layer and base membrane.And the level of ras mRNA increased obviously，reaching the peak30min and maintaining to120min after the pr
5、ovocation.The expression of Ras was also enhanced in epithlium and smooth muscle layers of airway，but MAPK increased only in smooth muscle cells.CONCLUSION Ras-MAPK signal transduction pathway plays an im-portant role in airway remodeling in asthma at early age，thus blocking the pathological process
6、 may be a potential treat-ment strategy. 0 引言 3气道重塑（airway remodeling）是指哮喘患者气道中平滑肌和基底膜增厚的异质性改变.由此导致气流不可逆阻塞和持续的气道高反应性，现认为是顽固性哮喘的重要病理基础1 .我们的前期研究2 结果表明，气道壁 c-fos，c-myc，c-jun 和 c-sis 等原癌基因表达增强是气道重塑的重要早期事件.那么，真核细胞中对生长和发育具有调节功能的 Ras-MAPK 信号转导系统，在重塑中是否介导基因的表达过程?目前尚不清楚.我们以豚鼠哮喘模型为对象，探讨 Ras-MAPK 途径激活情况与气道重塑的
7、关系. 1 材料和方法 1.1 材料 抗 pan-Ras 及 MAPK mAb 分别购自武汉博士德、Sigma 公司 .含 ras cDNA 的质粒由第四军医大学生物化学和分子生物学教研室提供，Trizol 购自 Gibco 公司，质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司，各种限制性内切酶购自宝灵曼公司. 1.2 方法 1.2.1 动物模型及标本制备 第四军医大学实验动物中心提供成年雄性豚鼠 40 只，体质量 300350g ，随机平分为哮喘组和正常对照组.哮喘组用 10gL-1 卵蛋白（OVA）和410gL-1 氢氧化铝混悬溶液 0.5mL，ip，致敏，第 8 日重复注射 1 次
8、;第 15 日始雾化吸入 OVA 激发动物哮喘发作，隔日 1次，共 10 次.对照组以同样方法致敏，但吸入生理盐水而非 OVA.分别在末次激发试验后即刻、30，60，120 及 240min 处死相应动物.提取总 RNA:动物放血后，迅速剥离气管及主支气管，Trizol 法提取总 RNA; 制备发作后 30min 动物气道组织切片:40gL-1 多聚甲醛经右心室灌注并取气管和肺，200gL-1 蔗糖浸泡后，于-20 下制备 20m 冰冻切片. 1.2.2 Dot-blot 杂交法检测气道 ras mRNA 的表达 将含 ras cDNA 的质粒转染 DH5 感受态细菌，扩增制备质粒，用 Eco
9、R和 BamH双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收 cDNA 片段，并 -32 P-dCTP 随机引物法标记 cDNA 探针. 将提取的总 RNA 移至尼龙膜上，预杂交后加入含探针的杂交液进行反应.放射自显影后图像分析仪行灰度扫描半定量. 1.2.3 免疫组织化学法检测气道 Ras 和 MAPK 的表达 切片经 KPBS 漂洗后，分别加入小鼠抗鼠 Ras 或 MAPK mAb（1100） ，4孵育 48h.漂洗 3 次，加入生物素化羊抗小鼠IgG（ Sigma，1400） ，4h 后漂洗并与 ABC 复合物（1400）孵育 2h.DAB 与硫酸镍胺醋酸缓冲液的混合液作为显色剂.判断标准: 细胞质呈清晰
10、灰黑色为阳性;根据显色强度和范围分为阴性（-）:无阳5性细胞染色;弱阳性（+）:气道阳性细胞小于 50%或显色浅;强阳性（）: 阳性细胞大于 50%或显色深. 2 结果 2.1 哮喘豚鼠气道组织形态学结果 与正常对照组相比，哮喘组豚鼠气道上皮水肿、脱落明显，气道平滑肌层和基底膜增厚，尤以前者显著.管腔内有粘液栓形成. 粘膜、粘膜下层等气道壁有不同程度的炎性细胞浸润.气道周围小血管充血明显，并有大量炎性细胞渗出. 2.2 哮喘豚鼠气道 ras mRNA 的表达 对照组 Dot-blot 杂交信号较弱，表明正常豚鼠气道低水平表达 ras mRNA.哮喘组动物经过激发致喘后，杂交信号显著增强，灰度值
11、以致喘后 30min 和120min 为最高，约为对照组的 4 倍.表明气道 ras mRNA 表达明显上调，并在 30120min 时段呈高峰状态.240min 时表达水平基本恢复正常. 2.3 哮喘豚鼠气道 Ras 蛋白的表达 Ras 主要位于胞质中，阳性蛋白为灰黑色颗粒.正常豚鼠气道呈现着色阴性或弱阳性（Fig1） ，而哮喘组气管、支气管及细支气管的上皮细胞、平滑肌细胞表现为强阳性，血管内皮细胞及少数炎性细胞呈现散在阳性.肺泡上皮细胞6也表现出广泛阳性（Fig2）. 2.4 MAPK 蛋白在哮喘豚鼠气道的表达 MAPK 蛋白也存在于胞质中，阳性蛋白呈现灰黑色.免疫组化染色结果表明，正常豚
12、鼠气道表达水平极低（Fig3）.哮喘豚鼠气道的平滑肌层则表现出较强阳性，并以细支气管为主.但上皮细胞的 MAPK 蛋白量无明显变化（Fig4）. 图 1图 4 略 3 讨论 气道重塑是哮喘慢性非特异性炎症反复迁延的终末形态学改变，主要表现为平滑肌增厚、成肌纤维细胞增殖、胞外基质增多、血管充血及血管壁肥厚等.目前认为，多种炎性介质和细胞因子作用于细胞膜受体，经过特定的胞内信号转导途径，改变原癌基因的表达，是激发气道重塑的首要因素3-5 .因此阐明重塑过程的信号转导机制，将为气道病理改变的早期防治提供理论基础. 受体酪氨酸激酶-Ras-MAPK 是将外界刺激信号（如部分神经递质及几乎所有细胞因子）
13、传递到细胞核内的最重要途径，其中 Ras作为信号开关分子调节细胞的生长和分化6 .ras 基因与肺癌发生的密切关系已受到人们关注.据报道，15%60%的非小细胞肺癌中存在 ras 的扩增或点突变，致使该蛋白 GTPase 活性下降，从而7活化状态得以维持，细胞持续增殖7 .我们的研究结果表明，致敏豚鼠被激发哮喘后，短时内气道 ras mRNA 表达水平明显上调，并在 30min 时达到峰值 .免疫组化结果也显示，Ras 蛋白表达量明显高于正常对照组，主要分布于气管、支气管上皮细胞和平滑肌细胞，以及少数炎症细胞内.推测 Ras 蛋白水平升高与细胞增殖为特征的哮喘气道重塑有着一定联系.Yoakum
14、 等8 用含有 ras 的质粒转染体外培养人支气管上皮细胞，发现细胞增殖活性明显升高，对培养基中生长因子需求量减少，染色体变为非整倍体.Anderson 等9 临床研究也证实，慢性阻塞性肺疾病患者血清中 Ras 蛋白浓度显著高于健康人，与气道的修复、增厚等病理改变密切相关.这些研究报告进一步支持了本项研究对 ras 在气道重塑中所起作用的推测. MAPK 属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是 Ras 的重要下游分子，能经过 Raf，MAPKK 的级联反应被 Ras 间接激活.MAPK 处于胞质信号转导通路的终末位置，通过调控基因表达来促进细胞增殖10 .Karin11 研究表明，Ras 及 MAPK 能
15、有效激活原癌基因 c-fos和 c-jun 合成的异二聚体蛋白 AP-1，并且 MAPK 还能提高 c-jun的转录活性12 .而这些原癌基因在哮喘气道重塑中的启动作用已被证实2 .本研究结果也证实，与对照组相比，气道平滑肌细胞 MAPK 蛋 白表达量明显增加，与哮喘气道平滑肌层增厚的病理结果相一致.综上可见，Ras-MAPK 途径的激活是哮喘气道重塑的早期事件，阻断该过程是值得探讨的治疗手段. 8参考文献: 1Homer RJ，Elias JA.Consequences of long-term inflammation，Airway remodeling Review.Clin Chest
16、Med，2000;21（2）:331-343. 2Liu YG，Qi HW，Li HZ.Proto-oncogenes expression in airway remodeling in asthma J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22 （5）:418-420. 3Oyamada H，Kayaba H，Kamada Y，Kuwasaki T，Yamada Y，Kobayashi Y，Cui C.An optimal condition of bronchial cell pro-liferation stimulated by insulin-like growth factor-I J.Int Arch Allergy Immunol，2000;122 （Suppl1）:59-62.
