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1、1NMDA 和 AMPA 型谷氨酸受体亚基在成年大鼠前脑室管膜及室管膜下区的分布作者： 魏丽春，石梅，曹荣，陈良为 【关键词】 谷氨酸受体；NMDA 受体； AMPA 受体；室管膜；免疫组织化学cnLocalization of NMDA and AMPAtype glutamate receptors in forebrain ventricular membrane and subventricular zone of adult rats【Abstract】 AIM: To investigate the distribution patterns of NMDAtype and AMP
2、Atype glutamate receptor subunits in the forebrain ventricular membrane and subventricular zone of adult rats. METHODS: Immunohistochemical staining was applied to visualize the localization of 5 kinds of NMDA and AMPA receptor subunits in the forebrain sections of adult rats. RESULTS: The immunorea
3、ctivities for NMDAR1 (NR1), NR2C, AMPA receptor subunit 1(GluR1), GluR2/3, and GluR4 were detected in the ventricular membrane and subventricular zone. The immunoreactive products for NMDA 2or AMPA receptor subunits were homogeneously localized in the cytoplasma and cell membrane. Semiquantitative a
4、nalysis indicated that NR1 and GluR4immunoreactive cells were more and distributed more densely than NR2C, GluR1 or GluR2/3immunopositive ones in ventricular membrane and subventricular zone. CONCLUSION: The localization of NMDA and AMPA receptor subunits in the ventricular membrane and subventricul
5、ar zone suggests that NMDA and AMPA receptors may be involved in functional modulation of neurogenesis in above regions.【Keywords】 glutamate receptors; NMDA receptor; AMPA receptor; ventricular membrane; immunohistochemistry【摘要】 目的：观察前脑室管膜及室管膜下区 N 甲基 D 天门冬氨酸（NMDA）和使君子酸（AMPA ）型谷氨酸受体的分布 . 方法：应用成年 SD 大
6、鼠前脑切片免疫组织化学方法，显示 NMDA 和AMPA 受体六种亚基的细胞定位. 结果：在室管膜及室管膜下区有NMDA 受体亚基 NR1，NR2C 及 AMPA 受体亚基GluR1，GluR2/3，GluR4 免疫反应阳性产物的分布，免疫阳性产物则均匀地分布在细胞质或细胞膜. 半定量分析表明 NR1 和 GluR4阳性细胞的数目和染色密度均高于 NR2C，GluR1 和 GluR2/3 阳性3细胞. 结论：结合以往研究，NMDA 和 AMPA 受体亚基在大鼠前脑室管膜及室管膜下区定位结果提示 NMDA 和 AMPA 受体可能参与该区域神经发生等功能活动的调节.【关键词】 谷氨酸受体；NMDA
7、受体； AMPA 受体；室管膜；免疫组织化学0 引言兴奋性氨基酸是参与神经元兴奋性传递、增殖发育、兴奋性毒性等活动的重要递质1-5. 其兴奋性传递主要由谷氨酸受体来介导，包括 N 甲基 D 天门冬氨酸（ NmethylDaspartate，NMDA） 、使君子酸（alphaamino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionic acid，AMPA）和海人藻酸（kainic acid，KA）受体1-2. 以往对 NMDA 和 AMPA 受体在脑内神经元上分布和功能已有许多报道6-9 ，但缺乏对室管膜及室管膜下区分布和功能的研究. 资料表明室管膜及室管膜下区是成年动物神经发
8、生活跃的主要区域之一. 为此，我们应用免疫组织化学方法10 ，观察 NMDA 和 AMPA受体在大鼠室管膜及室管膜下区的分布，旨在探讨 NMDA 或AMPA 受体参与该区神经发生等功能活动的意义.1 材料和方法411 材料正常成年雄性 SD 大鼠 6 只，由第四军医大学实验动物中心提供. 第一抗体包括小鼠抗 NR1 抗体(11000) ，兔抗NR2C 抗体（11000） ，兔抗 GluR1，GluR2/3，GluR4 抗体（1300）均为 Chemicon 公司产品；biotin 标记的羊抗小鼠 IgG或羊抗兔 IgG (1200)，Vector 公司产品；ABC 复合物(1200), Vec
9、tor 公司产品.12 方法121 动物固定与切片动物在戊巴比妥钠 (40 mg/kg，ip)麻醉下，开胸、经左心室至主动脉插管，用生理盐水约 100 mL 快速冲去血液，随即灌注含 40 g/L 多聚甲醛 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液(pH 7.4)，灌流 30 min. 注毕立即取出大脑, 4下后固定 4 h. 然后换入300 g/L 蔗糖溶液内，4下过夜. 冰冻连续冠状切片，片厚 30 m. 切片按顺序分为数套，分别作 NMDA 受体亚基NR1， NR2C，AMPA 受体亚基 GluR1，GluR2/3 和 GluR4 免疫组织化学染色和对照染色.122 免疫组织化学染色参照文献 1
10、0的方法进行，切片于10 mmol/L PBS 内涮洗 , 再入含 0.3 mL/L 过氧化氢溶，液内处理30 min，用以灭活内源性过氧化物酶. 经 PBS 涮洗后，分别入第一5抗体血清（用含 2 mL/L 正常山羊血清和 0.1 mL/L Triton X100 的PBS 稀释）内，4下孵育 48 h. 然后入 biotin 标记的羊抗小鼠IgG 或羊抗兔 IgG (1200)溶液，室温下放置 4 h、入 ABC 复合物(1200,)溶液，室温下孵育 2 h. 每次抗体孵育后均用 PBS 涮洗，310 min. 最后入 DAB/H2O2 溶液(0.050.01 g/L)反应 10 min.
11、 用正常血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照. 切片裱于载玻片上，晾干、脱水、透明和封片，在 BX60 显微镜下进行观察、图像采集和阳性细胞计数分析.123 半定量数据分析为便于描述前脑室管膜及室管膜下区内NMDA，AMPA 受体免疫阳性细胞的数量，将阳性细胞密度分为高（多于 10 个细胞/高倍视野，表示为）,中（310 个细胞/高倍视野，表示为）,低（低于 3 个细胞/高倍视野，表示为+）.2 结果21NMDA 和 AMPA 受体亚基免疫反应产物的定位特征在应用特异性第一抗体孵育的切片上，免疫反应产物呈深棕色，主要定位于细胞胞体及突起上. NMDA 受体和 AMPA 受体亚基
12、NR1， NR2C，GluR1 ，GluR2/3 和 GluR4 的免疫反应阳性产物呈均匀的棕色分布在细胞质或细胞膜上. 在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，未发现阳性染色.622NMDA 受体亚基在成鼠室管膜及室管膜下区的定位 NR1及 NR2C 阳性产物均匀地分布在细胞质或细胞膜，室管膜及室管膜下区均有免疫阳性细胞存在，NR1 的免疫染色强度和阳性细胞的密度均比 NR2C 大（图 1）.A: NR1; B: NR1; C: NR2C; D: NR2C.23AMPA 受体在室管膜及室管膜下区的分布 GluR1 和GluR2/3 的免疫阳性产物主要分布在细胞体及其突起内，阳性细胞密
13、度比较稀疏，GluR2/3 的染色强度更淡. GluR4 分布在室管膜下区的细胞内，染色强度深，阳性胞体密集分布（图 2）.24NMDA 和 AMPA 受体分布的半定量分析通过对前脑室管膜及室管膜下区内 NMDA，AMPA 受体免疫阳性细胞的观察，结果表明免疫阳性细胞密度从高到低依次为：NR1（） ，GluR4（） ，GluR2/3（） ，NR2C（ +）和 GluR1（+） .3 讨论前脑室管膜下区与海马齿状回是成体动物脑内神经发生或活跃的主要增殖区，在脑结构功能可塑性和损伤修复中具有重要意义. 结合以往资料1-5,8-9 ，本研究显示了成年大鼠前脑室管膜及室管膜下区内存在五种 NMDA 和
14、 AMPA 受体免疫阳性细胞的分布，结果提示 NMDA 和 AMPA 受体所介导谷氨酸信号参与前脑室管膜及7室管膜下区细胞的功能活动，可能是该区域内的神经发生活动的重要调节因素之一.NMDA 受体属于钙离子通透性离子通道，除介导神经细胞间的兴奋性信号传递外，还参与神经发育和可塑性活动，在细胞增殖、迁移、损伤与死亡过程中发挥重要作用1-6,8,11. 应用 NMDA受体的拮抗剂 CGP43487 后 2 d 即见海马齿状回内 BrdU 阳性增殖细胞增多，用后 7 d 仍见大量的增殖细胞，并见早期颗粒神经元、放射状胶质细胞的增多4. 脑缺血可以引起海马 CA1 区锥状神经元的死亡，在脑缺血的同时给
15、予 NMDA 受体拮抗剂 MK801 则可以阻断细胞的死亡5. AMPA 受体依构成亚基的差异，其受体功能特性具有明显的差别1,6,12. GluR1 和 GluR4 为钙离子通透性 AMPA 受体，GluR2 为钙离子非通透性受体 1,7,12. 研究表明 AMPA 受体也参与兴奋性毒性和细胞增殖过程2,5,9,13-14. 在受损伤的细胞中 GluR2 表达增多，而 GluR3，4 表达减少13 . AMPA 受体的活化可以抑制小脑内少突胶质前体细胞的分裂与增殖，但不改变星形胶质细胞的数量14.另外，我们还发现 NMDA 或 AMPA 受体在室管膜及室管膜下区的细胞上与 Nestin 共存
16、（待发表资料） ，辐射损伤引起动物室管膜及室管膜下区内神经前体细胞标记物 Nestin 表达和细胞增殖标记物 Ki67 染色细胞增加，提示辐射损伤对该区域神经前体细胞的机能8或增殖产生明显影响15. 还有研究证明脑组织或脑室内直接给予 NMDA 或 AMPA 能够引起前脑室管膜下区的细胞增殖变化，提示 NMDA 和 AMPA 受体可能与该区的神经发生活动有密切关系8-9 . 因此，NMDA 和 AMPA 受体参与成体动物前脑室管膜和室管膜下区的神经发生活动调节、及其在损伤修复中的功能意义，值得进一步研究.【参考文献】 1 Ozawa S, Kamiya H, Tsuzuki K. Glutamate receptors in the mammalian central nervous system J. Prog Neurobiol, 1998, 54(5):581-618. 2
