《CRISPR-Cas9基因敲除小鼠.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CRISPR-Cas9基因敲除小鼠.ppt（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、CRISPR Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling CRISPR Cas9系统的原理 crRNA CRISPR derived RNA 通过碱基 配对与 tracrRNA trans activating RNA 结 合形成 tracrRNA crRNA 复合物 此复合物引导 核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位 点剪切双链 DNA 而通过人工设计这两种 RNA 可以改造形成具有引导作用的sgRNA short guide RNA 足以引导 Cas9 对 DNA 的定点 切割 2015 2 52 CR
2、ISPR Cas9系统的原理 2015 2 53 sgRNA target通过设计sgRNA来确定剪切位点 设计简单快速 无需重复构建核酸内切酶 Cas9的局限性 受限于转基因范围 Cas9往往只用与细胞或胚 胎层面的实验 本实验采用Cre dependent Rosa26 Cas9 knockin mouse克服了这个局限性 使得CRISPR Cas9应用更广泛 2015 2 54 Cre dependent Cas9 Rosa26 targeting 矢量图 2015 2 55 荧光蛋 白 Rosa26 使转 录可被诱导 转入Cas9后与野生小鼠对比 2015 2 56 2015 2 57
3、 神经系统荧光对比 三种实验测试效果 三种转接方法 纳米粒子 腺病毒转导 慢病毒转导 三个系统 器官 免疫 神经 肺 癌 2015 2 58 一 慢病毒转入树突状细胞 2015 2 59 转入树突状细胞实验过程 2015 2 510 通过荧光蛋白EGFP可以鉴别 Cas9是否转导成功 设计了两个剪切位点 2015 2 511 有转入目的基因 的小鼠大多细胞目的 基因发生移码突变 目的基因转录和翻译 都明显下调 2015 2 512 二 腺病毒转入大脑皮层额叶 2015 2 513 目标基因是NeuN 目的基因发生的改变 2015 2 514 缺失一位 缺失多位 插入一位 插入多位 2015 2
4、 515 荧光显示含有 Cre Cas9的组织中NeuN表 达明显减少 而非转入非 目标的sgRNA则目标蛋白无 影响 NeuN被破坏的比例十分大 2015 2 516 Indel insertions 插入 and deletions 删除 多数为两个等位基因都被破坏 且其 中多为移码突变 2015 2 517 三 腺病毒转入肺 2015 2 518 2015 2 519 sgKrassgp53 sgLkb1 Kras同源 修补 P53的基因变化 多为移码突变 2015 2 520 Lkb1的基因变化 多为移码突变 2015 2 521 Kras的基因变化 2015 2 522 P53和Lkb1不断被损坏 Kras则被修补变得越发优势 2015 2 523 最终肺中出现肿瘤 2015 2 524 2015 2 525 总结 事实证明将Cre dependent引入Cas9工具中 可以大大扩展Cas9的用途 以后用此方法可以更好的对基因进行修整 已达成更多的实验 为人类医学和生物学作 出贡献 2015 2 526 Thanks
