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1、1Caveolin-3 在白藜芦醇改善高脂诱导骨骼肌胰岛素抵抗中的作用邵明明 苏嘉 陈泽楷 杜雨末 金希 谈智【摘要 】 【目的】在高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠模型上,探讨微囊蛋白 3(CAV-3)在白藜芦醇改善骨骼肌胰岛素抵抗中的作用及机制?【方法】 实验大鼠分 3 组:正常饮食组(NORM),高脂饮食组(HFD),高脂饮食加白藜芦醇干预组(HFD+ RSV)?通过空腹血糖 ?胰岛素浓度? 计算胰岛素敏感指数?腹腔葡萄糖耐量试验以及 2-脱氧-3H 葡萄糖的摄取,从整体上探讨白藜芦醇对胰岛素抵抗的保护作用? 再通过免疫印迹检验微囊蛋白 3(CAV-3)与葡萄糖转运蛋白 4(GLUT4)在以上过程
2、中的表达情况?【结果】 HFD 能显著诱导胰岛素抵抗 ,补充 RSV能抑制高脂的诱导作用?离体骨骼肌实验证实,RSV 的保护作用与其促进胰岛素诱导的葡萄糖摄取有关?免疫印迹证实 RSV 能够增加骨骼肌 CAV-3 蛋白表达, 促进 GLUT4 向细胞膜的转运?【 结论】 白藜芦醇能改善高脂诱导的胰岛素抵抗,其保护作用与其上调 CAV-3 蛋白表达,促进 GLUT4 向细胞膜转运,改善骨骼肌葡萄糖的摄取有关? 【关键词】 白藜芦醇; 胰岛素抵抗; 微囊蛋白; 葡萄糖转运蛋白 4Abstract:【Objective】 In the high-fat-induced insulin 2resist
3、ance rat model, the role of caveolin-3 (CAV-3) in the effect of resveratrol (RSV) on insulin resistance in skeletal muscles was studied. 【Methods】 Rats were divided into three groups: normal diet group (NORM), high-fat diet group (HFD), high-fat diet plus resveratrol group (HFD + RSV). The protectiv
4、e effect of resveratrol on insulin resistance were studied by measuring fasting glucose, fasting serum insulin, insulin sensitive index (ISI), intraperitoneal glucose tolerance test, and 2-deoxy-3H glucose uptake in vitro soleus muscles. Expression of caveolin-3 (CAV-3) and glucose transporter 4 (GL
5、UT4) in the above processes were measured by Western blot analysis. 【Results】 RSV has protective effect on high-fat diet-induced insulin resistance. RSV elevated insulin-stimulated glucose uptake in isolated soleus muscle in vitro by enhancing GLUT4 translocation to the plasma membrane rather than i
6、ncreasing GLUT4 protein expression. RSV increased CAV-3 protein expression, which contributed to GLUT4 translocation. 【Conclusion】 The results showed that RSV ameliorates insulin resistance by increasing glucose uptake in skeletal muscles through a CAV-3-dependent pathway, and the mechanism was that
7、 RSV up regulates CAV-3 protein expression and enhances GLUT4 translocation to 3plasma membrane.Key words: resveratrol; insulin resistance; caveolin-3; glucose transporter 4骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSC)是一种多能干细胞,不但具有多向分化潜能 ,还具有免疫调节作用?近来研究表明1-2,MSC 可以延长多种移植物的存活时间?我们前期研究显示3,用白细胞分化抗原 40 配
8、体免疫球蛋白(CD40LIg)阻断 T 细胞共刺激通路可抑制异种胰岛移植的排斥反应,但不能维持移植物的长期存活?同样,有研究显示单独使用 MSC 也不能维持移植物的长期存活4?因此 ,我们建立 Wistar-SD 大鼠异种胰岛移植模型,用 CD40LIg 基因修饰的 MSC 进行干预治疗,同时发挥 CD40LIg 和MSC 的作用,探讨 CD40LIg 基因修饰的 MSC 在异种胰岛移植排斥反应中的作用?1 材料与方法1.1 材 料雄性 Wistar 大鼠,体质量约 200250 g,作为胰岛细胞和骨髓间充质干细胞(MSC)供体;雄性 SD 大鼠, 体质量约 200250 g,为胰4岛移植的受
9、体(由中山大学医学动物实验中心提供);抗 CD40LIg 单克隆抗体?抗胰岛素单克隆抗体?免疫组织化学试剂盒和 ELISA 试剂盒(由深圳晶美生物有限公司提供);携带分泌型 CD40LIg 基因的重组腺病毒载体质粒由本中心构建;Ficoll 400 试剂(由瑞典 Amersham 公司提供)?1.2 胰岛的分离和纯化Wistar 大鼠在 100 g/L 水合氯醛( 按体质量 40 mg/kg)麻醉下, 开腹经胆总管插管灌注胶原酶, 等胰腺肿胀后切取胰腺,将胰腺剪成小块置入消化器中,37.5消化 58 min,收集消化产物?将消化物在 37 ?体积分数为 5% CO2 的恒温培养箱中培养 48
10、h 后,用25%?23%?20%?11% 的 Ficoll 400 不连续密度梯度液进行纯化,将纯化产物置于 30 ?体积分数为 5%CO2 的恒温培养箱中培养备用 ?1.3 骨髓间充质干细胞 (MSC)分离和培养Wistar 大鼠拉颈处死后取股骨与胫骨进行分离, 制成骨髓细胞悬液, 并与等量 DMEM 混合后离心,再加入 Percoll 分离液离心,抽取有核细胞层,加入含 100 mL/L 胎牛血清的 DMEM,接种于培养瓶中,置于 37 ?体积分数为 5% CO2 的恒温培养箱中培养?接种 48 h 后更换培养液,之后每隔 3 d 更换一次培养液?待培养细胞接近 80%融5合后, 再用 0
11、.25%胰酶消化, 传代培养至第 5 代细胞备用?1.4 骨髓间充质干细胞 AdCD40LIg 转染用多重感染复数(MOI)为 100 的重组 5 型野生型腺病毒AdCD40LIg 病毒液感染 MSC(转染率达 90%以上),置于 37 ?体积分数为 5% CO2 的恒温培养箱内培养 48 h 后,备用?1.5 异种胰岛移植模型和实验分组将 AdCD40LIg 转染的 MSC 和 Wistar 大鼠胰岛细胞用培养液调整细胞浓度分别为 4106 个/mL 和 8 000 IEQ/mL?将 45 只用静脉注射链脲佐菌素造模成功的糖尿病大鼠随机分为 A?B?C 3 组(每组 15 只),在 100
12、mg/L 水合氯醛(按体质量 40 mg/kg)麻醉下,将 0.25 mL AdCD40LIg 转染的 MSC(约 1106 个 MSC)和 0.25 mL 胰岛细胞悬液( 约 2 000 IEQ 胰岛细胞)注入左肾被膜下?A 组仅植入胰岛细胞,作为对照组; B 组植入胰岛细胞和 MSC;C 组植入胰岛细胞和 AdCD40LIg 转染的 MSC?1.6 观察指标移植后观察移植大鼠的一般情况和存活情况;第 1 周内每天检6测 1 次血糖,从第 2 周开始每隔 2 d 测 1 次血糖?当血糖恢复正常后,如连续 2 次血糖高于 16.0 mmol/L,以第 1 次时间为排斥反应开始?在移植前 1 d
13、 和移植后 3?7?14?21?28?35 d 分别采取胰岛移植大鼠外周血,采用 ELISA 方法检测 TNF- 和 IL-2 的水平? 分别于胰岛移植后 15 d 和 30 d,取移植大鼠移植物,作病理组织学检查;用 SP 免疫组织化学染色法检测移植物 CD40LIg 和胰岛素蛋白的表达 ?1.6 统计学方法数据以表示,SPSS 11.0 软件进行统计分析, 采用 t 检验和单因素方差分析分别进行两组样本均数和多组样本均数的比较,P0.05为差异有统计学意义?2 结 果2.1 糖尿病大鼠胰岛移植后血糖的变化糖尿病大鼠血糖平均在胰岛移植后 2 d 恢复正常,对照组血糖平均在移植后 7 d 开始
14、升高;单纯 MSC 组和基因转染 MSC 组血糖分别在移植术后 20 d 和 47 d 升高?2.2 移植糖尿病大鼠和胰岛移植物存活情况7对照组?单纯 MSC 组和基因转染 MSC 组移植物存活时间分别为(9.5 3.2)d?(25.2 5.3)d 和(53.6 7.5)d,各组间比较具有显著差异(F=5.362,P 0.05);移植糖尿病大鼠生存时间分别为(24.1 6.8)d?(51.7 7.9)d?(95.2 12.7)d,各组间比较差异具有显著性(F=6.821,P 0.05)?2.3 糖尿病大鼠胰岛移植后细胞因子的变化对照组在移植后 IL-2 和 TNF- 的水平快速上升,而 IL-
15、4 和IL-10 的水平较移植前显著下降(P 0.01);2 个治疗组细胞因子水平的变化和对照组正好相反(图 1)?2.4 胰岛移植物病理学检查和免疫组织化学染色结果移植后 15 d,两个治疗组移植物内均可见成片的胰岛细胞团,无明显的淋巴细胞浸润;免疫组化染色可见胰岛素蛋白的表达(图 2A);而对照组移植物可见的胰岛细胞坏死和大量淋巴细胞浸润(图 2B)?移植后 30 d,基因转染 MSC 组移植物内可见成片的胰岛细胞,无明显的淋巴细胞浸润;并可见棕黄色的胰岛素和 CD40LIg 蛋白的表达(图 2C)?MSC 组则见胰岛细胞变性?坏死, 大量淋巴细胞浸润?3 讨 论8排斥反应目前仍是影响胰岛
16、移植疗效的主要因素,而排斥反应的免疫应答过程主要由 T 淋巴细胞介导完成? 骨髓间充质干细胞(MSC)是一类骨髓来源的多能干细胞,具有低免疫原性和免疫调节功能?多种体外实验研究均证实 MSC 可抑制 T 淋巴细胞的增殖5-8?有研究报道8,在 MSC 和 T 淋巴细胞的混合培养中,由丝裂原刺激的T 细胞增殖被抑制, 并且这种抑制作用在去除 BMSC 后消失?通过建立异种胰岛移植模型,用 MSC 进行干预治疗,结果显示MSC 组的胰岛移植糖尿病大鼠和移植物的生存时间较对照组显著延长, 排斥反应明显被抑制?MSC 抑制胰岛移植排斥反应的机理还不清楚?有研究显示9,移植前输注 MSC 可通过抑制 T 细胞的增殖,延长心脏移植的存活时间?同样也有研究表明10,MSC 可调节 T 淋巴细胞的扩增,抑制大鼠肝脏移植的排斥反应的发生? 有学者认为 MSC 抑制胰岛移植排斥反应的机理可能和诱导辅助性 T 细胞(Th)细胞的分化
