《B淋巴细胞肿瘤患者胸腺近期的输出功能》由会员分享，可在线阅读，更多相关《B淋巴细胞肿瘤患者胸腺近期的输出功能（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1B 淋巴细胞肿瘤患者胸腺近期的输出功能作者：李扬秋，吴秀丽，杨力建，陈少华，耿素霞【摘要 】 本研究了解 B 细胞肿瘤患者胸腺近期输出 naive T 细胞的水平，以评价其 T 细胞免疫潜能。利用实时定量PCR（TaqMan）方法检测 61 例 B 细胞肿瘤患者（成人 BALL 20例，儿童 BALL 6 例，BCLL 4 例，BNHL 17 例，MM 14 例）外周血单个核细胞（PBMNC）中 T 细胞受体重排删除 DNA 环（Tcell receptor rearrangement excision circles, TREC）的含量，并根据外周血中 CD3 阳性率计算 CD3 细胞中
2、TREC 水平。5例 ALLCR 病人和 17 例正常人外周血作为对照。实验结果显示，正常人外周血中 TREC 拷贝数为 3.763.42/1 000 PBMNC 和5.874.96 /1 000 CD3+细胞，而各 B 细胞肿瘤组的 TREC 水平均显著低于正常人水平，其 TREC 水平在成人 BALL 为 0.531.52拷贝/1 000 PBMNC 和 2.013.93 拷贝/1 000 CD3+细胞（p=0.0005 和 p=0.0123） ，在 BCLL 为 0.110.15 拷贝/1 000 PBMNC，0.230.27 拷贝/1 000 CD3+细胞（p=0.0015 和p=0.
3、0381） ，在 BNHL 为 0.711.34 拷贝/1 000 PBMNC（p=0.0017） ，在 MM 为 0.530.90 拷贝/1 000 PBMNC（p=0.0018） 。ALLCR 组 TREC 水平同样低于正常人水2平，儿童 BALL 组 TREC 水平明显高于成人组。结论：各类 B 细胞肿瘤胸腺近期输出 naive T 细胞功能均明显降低，个体差异较大，在病人达到完全缓解期时，胸腺近期输出功能仍没有得到恢复，提示对病人有动态观察的必要性。 【关键词】 胸腺近期输出功能Thymic Recent Output Function in Patients with Bcell L
4、ymphocytic MalignanciesAbstract The aim of the study was to analyze the naive T cell level of thymic recent output in patients with Bcell malignancies, thereby to evaluate the potential Tcell function. Quantitative analysis of Tcell receptor rearrangcment excision circles (TRECs) in DNA of periphera
5、l blood mononuclear cells from 61 cases of Bcell lymphocytic malignancy (including 20 cases of adult BALL, 6 case of childhood BALL, 4 cases of BCLL, 17 cases of BNHL and 14 cases of MM) were preformed by realtime PCR (TaqMan), and TREClevel was detected according to the number of CD3positive cells.
6、 5 case of ALLCR and 17 normal individuals were served as controls. The results showed a 3dramatic reduction of TREC values in all groups of patients. The mean value of TRECs was 0.531.52 copies /1 000 PBMNC and 2.013.93 copies /1 000 CD3+cells in adult BALL (p=0.0005, p=0.0123), 0.110.15 copies /1
7、000 PBMNC and 0.230.27 copies/1 000 CD3+cells in BCLL (p=0.0015, p=0.0381), 0.711.34 copies /1 000 PBMNC in BNHL (p=0.0017), 0.530.90 copies /1 000 PBMNC in MM patients (p=0.0018), as compared with 3.763.42 copies /1 000 PBMNC and 5.874.96 copies/1000 CD3+cells in normal individuals, the TREC level
8、was significantly decreased in all groups of Bcell lymphocytic malignancy, as well as in ALLCR group. However, the TREC level in childhood BALL was significant higher than those in adult BALL group. It is concluded that the function of thymic recent outputing naive T cells in Bcell malignancies sign
9、ificantly decreases, however, the individual difference of thymic output function is obvious. The thymic recent output function can not be recovered during CR phase in patients with Bcell malignancies, so that dynamic analysis of TREC level is necessary.Key words TREC; thymic recent output function;
10、 leukemia; realtime PCR4J Exp Hematol 2007; 15(5):1023-1027血液肿瘤患者细胞免疫功能状况与疾病的预后有着重要的关系，T 细胞免疫在对抗肿瘤微小残留病中起关键作用。研究肿瘤患者的T 细胞免疫功能状况也是研究特异免疫治疗的一个重要问题。我们的前期研究发现，尽管白血病患者存在细胞免疫功能缺陷，患者体内仍存在特异性抗白血病的 T 细胞克隆1，2 ，但多数患者却未能使其发挥有效的抗白血病效应，其原因是否在于机体的免疫潜能缺陷。本研究进一步分析 B 淋巴细胞白血病患者外周血中信号结合T 细胞受体重排删除环（signal joint Tcell re
11、ceptor rearrangement excision circles, sjTREC，简称 TREC） ，了解胸腺近期输出功能情况，后者是反映机体的细胞免疫潜能的一个最重要指标3-6 。标本收集和处理经细胞形态学、细胞组织化学和细胞免疫学确诊的初发未治各类B 淋巴细胞肿瘤 61 例，其中成人 B 细胞 急性淋巴细胞白血病（BALL ）20 例，男 13 例，女 7 例，年龄 17-72 岁，中位年龄32 岁；儿童 BALL 6 例，男 5 例，女 1 例，年龄 3-14 岁，中位年龄 11.5 岁； B 细胞慢性淋巴细胞白血病（BCLL ）4 例，男 35例，女 1 例，年龄 53-80
12、 岁, 中位年龄 75 岁；B 细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL ）17 例，男 12 例，女 5 例，年龄 23-67 岁，中位年龄 47.5 岁；多发性骨髓瘤（MM）14 例，男 12 例，女 2 例，年龄30-76 岁, 中位年龄 55 岁。完全缓解期（CR）ALL 病人 5 例，男3 例，女 2 例，年龄 21-35 岁，中位年龄 31 岁；正常人 17 例，男6 例，女 11 例，年龄 25-51 岁，中位年龄 28 岁。收集这些患者和正常人血液样本，肝素抗凝血，外周血单个核细胞采用 Ficoll 分离法分离，一部分细胞用于检测 CD3+细胞阳性率（应用 CD3 单抗和间接免疫荧光标记方
13、法） ，一部分细胞按常规方法（酚抽提法）提取DNA。TREC 的实时定量 PCR 检测引物设计 引物和探针的核苷酸序列与我们已报道的相同7 。由于 TREC 是在 TCR 基因进行删除重排时，由在其两侧的 Rec和 J 两个删除片段的内侧重组形成一个环行 DNA，即 TREC。在扩增该 TREC 产物时，所设计引物的方向恰好与一般的 PCR 引物相反2，5 。RAG2TREC 标准品的构建 利用 2 对引物分别扩增所需的RAG2 和 TREC 的基因片段，经序列分析证实后分别将其克隆到TOPO TA 载体上（TOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，荷兰） ，6获得表达 T
14、REC 和 RAG2 双基因片段的质粒作为标准品7 。根据凝胶电泳和分光光度计检测结果，将标准品 DNA 浓度分别调整为107 、 106、105、104、103 、102、和 10/ 2 l DNA 等 7 组。实时定量 PCR（realtime PCR） 每一标本分别进行 2 次RAG2 和 2 次 TREC 的检测，总反应体积为 25 l，其中含标准品或100 ng 基因组 DNA，0.5 mol/L 各引物，0.2 mmol/L dNTP，1.5 U AmpliTaq Gold， 0.1 mol/L 的 6FAMTAMRA 探针和 PCR 缓冲液（含 4 mmol/L MgCl2） 。
15、在 95 变性 10 分钟后，共进行 45 循环扩增，每一循环包括 95 ， 30 秒和 64 ， 1 分钟。反应在 ABI PRISM 7700 Sequence Detector（PE 公司产品）中进行。反应分别设标准组（7 个浓度） 、阳性对照（2 个平行反应） 、阴性对照（2 个平行反应）及样品组 7 。统计学处理各组样本中 TREC 含量以均数标准差（SD）表示，显著性检验用两独立样本 t 检验，组间比较采用方差分析。结 果利用 2 对引物和探针，经实时定量 PCR 分别扩增标准品，获得7了相关性达到 0.995 以上标准曲线（图 1） ，各样本 DNA 检测经与标准曲线比对，分析获
16、得样本中 RAG2 和 TREC 的绝对拷贝数值，然后根据每个细胞含两个 RAG2 拷贝的规律，换算成每 1 000 个细胞中 TREC 的含量。计算公式为n=21000TRECs(1)+TRECs(2) / RAG2(1)+RAG2(2)而根据免疫荧光检测单个核细胞中 CD3+细胞的阳性率，从所检测的单个核细胞中 TREC 含量计算 CD3+细胞中 TREC 含量，计算公式为n=（TRECs/1000 单个核细胞）CD3+%本研究的结果显示，在 17 例正常人外周血中 TREC 的拷贝数为3.763.42 拷贝/1 000 PBMNC 和 5.874.96 拷贝/1 000 CD3+细胞（CD3 阳性率为 62.324.72%） 。在 B 细胞肿瘤病人中，绝大部样本的 TREC 水平均显著降低，其中个别样本 TREC 水
