《BMP2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs 向成骨方向分化的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BMP2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs 向成骨方向分化的实验研究（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1BMP2活性多肽体外定向诱导大鼠 BMSCs 向成骨方向分化的实验研究【摘要 】 骨形成蛋白2 （BMP2 ）具有较强的诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨方向定向分化的能力。天然的BMP2 数量有限，结构复杂，限制了其广泛应用。本实验设计合成了 BMP2 活性多肽，体外试验探讨其对 BMSCs 向成骨方向定向诱导成骨分化的能力，评价 BMP2 活性多肽的诱导成骨效应。方法实验分 2 组，诱导组和非诱导组。取 4 周的 Wistar 大鼠分离培养 BMSCs，传至第 3 代时，实验组，改用成骨诱导培养基（DMEM 完全培养基+BMP2 活性多肽 200 gml） 。非诱导组，仍采用
2、DMEM 完全培养基。继续培养 24 周，采用细胞爬片培养、碱性磷酸酶活性和钙含量测定、实时定量 PCR 检测型胶原（Col ）及骨桥蛋白（ OPN）mRNA 的表达，评价 BMP2 活性多肽的体外诱导成骨能力。 结果诱导组 BMSCs 生长良好，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，ALP 活性上升，钙含量增加，Col 和 OPN 的 mRNA 呈高表达。非诱导组，成骨特性不明显。 结论合成的 BMP2 活性多肽能有效地促进BMSCs 向成骨方向分化，是组织工程化骨中理想的诱导成骨的细胞因子。具有与天然 BMP2 类似的骨诱导活性，具有广阔的应用前景。 2【关键词】 BMP2 活
3、性多肽 骨髓间充质干细胞 导成骨Abstract：ObjectiveTo investigate the capability of synthesis BMP2derived peptide on osteogenic induction in bone marrow stem cells(BMSEs),and to evaluate the osteoinductivity of BMP2derived peptide in vitro.Method After segregating and cultivating four weeks Wistar rats marrow stroma
4、l cells in induction group were induced by osteogenasis medium containing 200 gg/ml BMP2derived peptide,and in noninductional group BMSCs were still culture with DMEM medium.Following continue culture for 24 weeks,cells film preparation,alkaline phosphatase activity and calcium deposition were measu
5、red.Type I collagen（CoM）and osteopontin（OPN ）mRNA expression were measured using realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQPCR ）technique.The capability of synthesis BMP2derived peptide on osteogenic induction of BMSCs was investigated.ResultAfter inductived with BMP2derived pept
6、ide.BMSCs cultured survived well greatly changed in cell morphology,and showed a biological and morphologie 3characteristics similar to those of osteoblasts.The lever of alkaline phosphatase activity and calcium deposition increased.Coland OPN mRNA were expressed at higher level.In noninductional gr
7、oup no conspicuous osteogenic induction was shown.Conclusion BMP2derived peptide can induce BMSCs to differentiate into osteoblasts.It has the similar capacity of osteogenic induction as nature BMP2,so BMP2derived peptide is an ideal cell agent for bone tissue engineering,and can be available widely
8、.Key words:BMP2derived peptide; BMSCs; osteoinductivity骨髓基质细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，在一定细胞因子作用下可向成骨细胞方向分化，目前已成为骨组织工程理想的种子细胞1 。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）属于 TGF 超家族成员，是一种多功能的生长因子，其中 BMP2 是最主要的骨形成调控因子2、3 。天然 BMP2 数量有限，且生物活性难以发挥4、5 。本实验根据 BMP2 的核心功能区氨基酸序列，固相合成法合成一条含 24
9、个核苷酸的短肽BMP2 活性多肽，体外诱导大鼠的 BMSCs 向成骨方向定向分化，评价其诱导效能。41 材料与方法1.1 主要仪器和试剂倒置相差显微镜（Axiovert35 ，Zeiss Corp，Germany） ；低糖DMEM 培养基（Cibco） ；胎牛血清（Cibco） ；胰蛋白酶（Sigma） ；碱性磷酸酶（ALP）活性试剂盒（南京间建成生物工程有限公司） ；细胞钙含量试剂盒（Sigma 公司） ；BMP2 活性多肽（本课题组与吉尔生化上海有限公司联合研制） 。1.2 BMSCs 分离和培养取 4 周龄健康 Wistar 大白鼠 2 只，由同济医学院动物实验中心提供，体重约 120
10、g，雌雄不限，10水合氯醛腹腔注射麻醉，双侧下肢剪毛，75酒精浸泡消毒 30 min（将大白鼠头露于外面） ，无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10 号注射器抽取 1 ml DMEM 完全培养基（含 20小牛血清， 100 mgml 青霉素，100 mgml 链霉素）自一端冲洗，制成单细胞悬液，以3104ml 细胞数接种至 100 ml 培养瓶中，置于 37 、5CO2 及饱和湿度孵育箱中，24 h 后全量换液，以后每 3 d 换液1 次。待细胞汇合成单层后，用 0.25胰蛋白酶进行 13 消化传代。51.3 BMSCs 的成骨诱导培养取体外扩增的第 3 传代细胞，以 1105 个cm2
11、 的种植密度接种到预置盖玻片的 6 孔培养板中传代培养。将传代细胞分为 2 组，诱导组：培养 24 h 后，改用成骨培养基（DMEM 完全培养基+BMP2 活性多肽 200 gml） 。非诱导组：仍采用 DMEM 完全培养基。2 组细胞持续培养，常规 34 d 换液 1 次，进行细胞形态学观察及生物学特性检测。1.4 细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性和钙含量检测成骨诱导培养基培养 5、10 、15 及 20 d 时，将 6 孔板中的细胞用 PBS 洗 2 次，0.25%胰酶消化 58 min，每孔加入培养基 1 ml 终止消化，4 10 000r/min 离心 5 min，再用 PBS 洗 3
12、次，加细胞裂解液破膜。按试剂盒进行 ALP 活性检测。于 520 nm 波长处测定吸光度（A 值） 。钙含量：培养皿用 PBS 洗 2 遍，加入 1 ml 0.5mol/L HCl，振荡过夜，次日 10 000r/min 离心 5 min，上清液用钙试剂盒（Sigma 公司）测定钙含量。每份上清液取 20 L，以等量无离子水为空白对照，按试剂盒说明进行操作，于 575 nm 波长处测 A 值。61.5 实时荧光定量 RTPCR 检测 Col 和 OPN mRNA 的表达1.5.1 引物设计在 NCBI 上搜索到大鼠 Col 和 OPN 基因，找到该基因的mRNA,结合使用 Primer 5 设
13、计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成引物。Col 引物序列：Forward primer：5CAGACGGGAGTTTCTCCTCGGACGT3 ；Reverse primer：5GACCAGGAGGACCAGGAAGTCCACGT3 ；OPN 引物序列：Forward primer：5TGGTTTGCCTTTGCCTGTTCG3 ；Reverse primer：5ATGGCTTTCATTGGAGTTGCTTG3 ；7actin 引物序列：Forward primer：5AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA3 ，Reverse primer：5ATGCTGCTTACATGTCTCGAT
14、3 。1.5.2 大鼠 BMSCs 的接种处理及细胞收集将生长良好的第 3 代 BMSCs 以 1105 个cm2 的密度接种预置盖玻片的 6 孔培养板中， BMP2 活性多肽诱导组培养 24 h 后改用成骨诱导培养基。非诱导组仍采用 DMEM 完全培养液；在第 14 d 时通过胰酶消化法收集细胞。每组各取 3 孔 FQPCR 复测。1.5.3 实时荧光定量 PCR 反应（FQPCR ）实验按 Trizol 试剂说明书进行。 SYBR Green I 荧光染料（购自美国 Biotium 公司） 。PCR 反应条件：94 30 min，53 30 min，72 30 min，50 个循环。1.5
15、.4 统计处理应用 SYBR Green 荧光染料技术行实时定量 PCR 反应，获取8各组标本的标准曲线，计算机分析 Ct 值。2 结 果2.1 BMSCs 的形态学改变倒置相差显微镜下观察，BMSCs 细胞呈圆形或椭圆形，分离培养 12 h 开始贴壁，呈圆形或椭圆形。3 d 细胞增殖，数量增多，呈梭形或多角形。57 d，细胞数量明显增多，呈单层生长。可长满瓶底。诱导组用含 BMP2 活性多肽 200 gml 的成骨性诱导培养基 34 d 后，培养细胞发生明显的形态变化，由梭形转变为肥硕梭形或多角形。2.2 ALP 活性及钙含量测定2 组分别于培养 5、 10、15 及 20 d 时收集细胞，按试剂盒说明书检测。每组 5 孔，以 x-s 表示（图 12） 。2.3 RTPCR 检测 Col 和 OPN mRNA 的表达大鼠 BMSCs 在 2 组培养基培养 14 d 后，Col 和 OPN mRNA 均有表达（表 1） 。9表 1 两组诱导 14 d 后 Col 和 OPN mRNA 的 Ct 值（n=3）Col mRNAOPN mRNABMP2 活性多肽诱导组23.800.23*25.542.72*非诱导组 34.563.8536.033.54F 值18.4316.57*单因数方差分析，在 =0.05 水平，F7.71，有显著性统计学差异。图 1 诱导组与非诱导组 AL
