《BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1BMPs型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】BMPs型突变受体 关键词:BMPs型突变受体;真核表达载体 0 引言 骨形成蛋白（BMPs）不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用，而且起着十分重要的调控作用1.与其他 TGF- 超家族成员一样， BMPs 在细胞表面与 BMP 的，型受体相互作用，型受体可以和过量的配体结合，而型受体与配体的结合则是特异性的2.tBRK3k 为 BMPs型突变受体，其可以阻断 BMP 的信号转导，这样，BMP 就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育，器官形成及细胞分化中的作用.因此，为研究 BMPs 信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们构建
2、了 BMPs型突变受体的真核表达载体，为此方面研究的开展奠定了基础. 1 材料和方法 1.1 材料 pSP64TL-tBRK3k 质粒为含有 BMPs型突变受体cDNA 的克隆质粒，由日本的 Nohno 教授（Kawasaki 医学院分子生物所）提供.真核表达载体 pCDNA3（neo）购自本校生物化学教研室. 限制性内切酶及 T4DNA 连接酶均购自华美公司.DNA 回收纯化试剂盒购自原平公司. 21.2 酶切鉴定及回收 3将 pSP64TL-tBRK3k 和pCDNA3（ neo）用 Hind和 Xba 双酶切，经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分别得到 0.6，2.9 和 5.4kb 的片段，用
3、试剂盒回收纯化 0.6kb和 5.4kb 的片段 . 1.3 连接、转化和克隆筛选 3取上述 tBRK3k 片段 5L和 pCDNA3（neo）片段各 2L，加入 T4DNA 连接酶、缓冲液和无菌水各 1L，16连接过夜.制备大肠杆菌 DH5 的感受态并转化. 挑取单个菌落，液体 LB 培养基 37振摇过夜，小提质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆，命名为 pC-4. 2 结果 2.1pSP64TL-tBRK3k 和 pCDNA3 的酶切鉴定 pSP64TL-tBRK3k 质粒经双酶切后，得到 2.9kb 和 0.6kb 两个片段;pCDNA3（ neo）经双酶切后，得到一个 5.4kb 的片段，符合
4、二者的物理图谱（图 1）. 图 1 略 2.2pC-4 的酶切鉴定 pC-4 经 Hind和 Xba 双酶切后，得3到 0.6kb 和 5.4kb 两个片段，证明 tBRK3k 基因已成功连入到pCDNA（neo）中（图 1）.3 讨论 TGF- 超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用，分别叫做型受体（约 5055KD ）和型受体（约 7080KD） 4.和其他 TGF- 超家族成员一样， BMPs 在细胞表面与 ，型受体相互作用. 型受体可以和过量的配体结合，而型受体与配体的结合则是特异性的.因此，为研究 BMPs 信号转导在机体发育中的作用，我们将突变型 BMPs型受体（tBRK3k）定向
5、克隆到pCDNA3（ neo）表达载体中（图 2）. 图 2 略 pCDNA3（neo）可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因，全长 5.4kb.其表达系统构件包括:CMV 启动子， SV40 复制起始点，SV40polyA，SV405端和 3端剪切序列等，多聚接头有 11 个可供利用的单一酶切位点. pC-4 真核细胞表达载体可用于研究 BMPs 信号对间充质细胞分化的调控，对于研究和阐明 BMPs 在机体发育中的作用有重要意义. 参考文献: 1WozneyJM，RosenV.Bonemorphogeneticproteinandmorpho-4geneticgenefamilyinbonefo
6、rmationandrepairJ.ClinOr-thop，1998;346:26-37. 2EstevezM，AttisanoL，WranaJLetal.Thedaf-4geneencodsabonemorphogeneticproteinreceptorcontrollingc.elegansdauerlarvadevelopmentJ.Nature，1993;365:644-649. 3J.萨姆布鲁克，EF.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南M.第 2 版.北京:科学技术出版社，1992:34-56. 4HeldinCH， MiyazonoK，TenDijkeP.TGF-signallingfromcellmembranetonucleusthroughSMADproteinsJ .Nature，1997;390 （4）:465-471.
