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1、1bFGF 对 rhBMP 2 诱导犬气管损伤后软骨再生的作用作者：李小飞 闫小龙 韩静 汪健 卢强 徐鉷 程庆书 【摘要 】 目的： 研究应用碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）促进重组人骨形态发生蛋白2 （rhBMP2 ）诱导犬气管环部分缺损后软骨再生的可行性. 方法: 切除连续 5 个气管环前端的部分软骨，形成 1 cm3 cm 的气管原位软骨缺损，建立犬气管软骨缺损模型 . 将 18 只犬随机分为 A，B，C 组，每组 6 只，A 组为对照组，于软骨缺损处未行任何处理，B 组于气管软骨缺损部位植入 rhBMP2/聚乙烯吡咯烷酮（PVP）复合材料，C 组于气管软骨缺损部位植入rhBMP2
2、/bFGF/PVP 复合材料. 于术后 12wk 处死各实验犬，行大体及组织学检查，组织学半定量测定新生软骨情况. 结果: A 组气管软骨损伤残端出现气管软骨软化现象，气管管腔狭窄明显，软骨缺损处未见新生软骨生成；B，C 两组气管软骨损伤部位残端未见气管软化，管腔狭窄不明显，软骨缺损处可见新生软骨及软骨岛生成，其中 C 组诱导新生软骨面积较 B 组更大(P0.05). 结论: rhBMP2/PVP 及 rhBMP2/bFGF/PVP 缓释系统均可诱导气管软骨再生，rhBMP2/bFGF/PVP 缓释系统效果优于 rhBMP2/PVP缓释系统. bFGF 可能具有促进 rhBMP2 诱导犬气管损
3、伤后软骨再生的作用. 2【关键词】 骨形态发生蛋白；碱性成纤维细胞生长因子；聚乙烯吡咯烷酮；气管；软骨；再生 【Abstract】 AIM： To investigate whether basic fibroblast growth factor (bFGF) enhances regeneration of tracheal cartilage in trachea injured canine induced by the recombinant human bone morphogenetic protein2 (rhBMP2). METHODS: A 1 cm3 cm gap was
4、 made in the anterior cervical trachea by removing 3 cm long strips of 5 sequential cartilages. In the control group (n=6), the gaps were left untreated. In the rhBMP2/PVP group (n=6), slow release system rhBMP2/PVP was implanted in each defect. In the rhBMP2/bFGF/PVP group (n=6), slow release syste
5、m rhBMP2/bFGF/PVP was implanted in each defect. The tracheas were harvested at 12 weeks postoperatively. The cervical tracheas were then removed and evaluated grossly and histopathologically. The areas of regenerated cartilage were calculated. RESULTS: Tracheomalacia and the stenosis of the tracheal
6、 lumen were observed in the control groups but no regenerated cartilage was detected in the control groups at 12 weeks after surgery. In contrast, no tracheomalacia and no obvious stenosis of the tracheal was observed in the rhBMP2/PVP group and rhBMP2/bFGF/PVP groups. 3Regenerated cartilage was als
7、o observed in both groups at 12 weeks after surgery. This regenerated cartilage maintained the integrity of the internal lumen for longer than 3 months. The areas of regenerated cartilage in rhBMP2/bFGF/PVP group were larger than those in rhBMP2/PVP group (P0.05). CONCLUSION: Both slow release syste
8、ms, rhBMP2/PVP and rhBMP2/bFGF/PVP, can induce regeneration of tracheal cartilage in a canine model. rhBMP2/bFGF/PVP has stronger effect in inducing the regeneration of tracheal cartilage, indicating that bFGF may enhance rhBMP2 to induce regeneration of rhBMP2 induced injured tracheal cartilage. 【K
9、eywords】bone morphogenetic protein; basic fibroblast growth factor; polyvinylpyrrolidone; trachea; cartilage; regeneration 0 引言 骨形态发生蛋白(BMP)能够在宿主体内诱导未分化的、有活力的间充质干细胞 (MSCs)定向分化为骨或软骨细胞1 ，已证实重组人骨形态发生蛋白2 （rhBMP2 ）可诱导气管移植体软骨再生2. 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)是一种多功能生物活性物质，作为毛细血管增殖刺激剂，能明显增强 BMP 在体内的成骨4诱导作用3. 我们将 BMP 与
10、 bFGF 复合聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 缓释材料用于气管软骨缺损修复，为气管软骨缺损修复寻求一种理想的材料. 1 材料和方法 1.1 材料 rhBMP2（第四军医大学西京医院全军骨科研究所)，小鼠肌袋生物学活性试验证实 rhBMP2 诱导成骨活性良好；bFGF(珠海东大生物制药有限公司)；PVP (第四军医大学西京医院全军骨科研究所，直径 1 mm，椭圆形，色白), 医用生物蛋白胶( 广州倍绣生物技术有限公司). 健康成年雄性杂种犬 18 只, 体质量1520 kg（西安地区）. HPIAS1000 彩色病理图像分析仪（同济医科大学千屏影像公司）. 1.2 方法 1.2.1 rhBMP2/P
11、VP 复合物的制备 4 将 rhBMP2 加0.1 mol/L PBS 溶液(pH=7.4)后，用物理方法匀浆成混悬液，PVP加 0.1 mol/LPBS 溶液溶解后即为有粘性的溶液，将 PVP 溶液与rhBMP2 混悬液充分混匀，PVP 与 rhBMP2 的复合量为 10 mg PVP5 g rhBMP2，90 mmHg 下负压抽吸，放入冻干机逐步冻干，分装，每份含 rhBMP2 5 g，环氧乙烷消毒后备用. 1.2.2 rhBMP2/bFGF/PVP 复合物的制备4 将rhBMP2 加 0.1 mol/L PBS 溶液(pH=7.4)后，用物理方法匀浆成混悬液，rhBMP2 和 PVP 加
12、 0.1 mol/L PBS 溶液溶解后即为有粘性的溶液，PVP 与 rhBMP2 的复合量为 10 mg PVP40 活性单5位(IU)bFGF. 将 bFGF/PVP 溶液与 rhBMP2 混悬液充分混匀，PVP 与 rhBMP2 的复合量为 10mg PVP5 g rhBMP2，真空抽吸，放入冻干机逐步冻干，分装，每份含 rhBMP2 5 g，bFGF 40 IU，环氧乙烷消毒后备用. 1.2.3 手术 动物分组 将犬随机分为 A，B，C 3 组，每组6 只，A 组为对照组，于软骨缺损处未行任何处理；B 组于气管软骨损伤部位植入 BMP/PVP 复合材料，C 组于气管软骨损伤部位植入 r
13、hBMP2/bFGF/PVP. 麻醉及手术操作方法 将速眠新按 0.15 mg/kg 肌肉注射全身麻醉. 仰卧位固定于手术台上, 经口气管插管，自主呼吸. 颈部正中纵形切口，长约 10 cm. 分离皮下及肌肉组织显露颈段气管，切开气管前筋膜. 切除连续 5 个气管环前端中线附近部分软骨，形成 1 cm3 cm 的气管原位软骨缺损，保留缺损局部的气管黏膜. B 组于气管软骨缺损部位植入 rhBMP2/PVP 复合材料，每环缺损植入 rhBMP2/PVP 1 mg；C 组于气管软骨缺损部位植入 rhBMP2/bFGF/PVP 复合材料，每环缺损植入rhBMP2/bFGF/PVP 1 mg（图 1）
14、. 医用生物蛋白胶封闭缺损部位，以防止局部渗血稀释复合物，逐层缝合颈部切口. 术后处理及取材时间 所有动物均于术后立即给予青霉素肌注 80 万 u，术后第1 日起肌肉注射青霉素 80 万 u，2 次/d ，共 7d，并接受相同喂养. 均于术后 12 wk 处死. 图 1 损伤模型及复合材料植入方法（略） 1.2.4 观察指标 动物存活情况 各组动物术后生存状况，6如有无切口感染、呼吸困难等现象. 大体改变 达到预杀期后将实验犬处死并立即取材，40 g/L 甲醛溶液中固定，观察气管的通畅程度. 组织学观察 各组标本进行软骨脱钙、脱水、固定、石蜡包埋及切片， HE 染色，光镜下观察. 定量组织学测
15、定新生软骨面积 冠状面连续切取软骨缺损区新生组织, 获得 4 m 厚的组织学切片，每隔 100 m 切取 1 张. 应用 HPIAS1000 彩色病理图像分析仪测定每只实验犬软骨缺损区总的新生软骨面积，于各标本每个环间缺损植入复合物区，随机选取 10 个200 视野作为测定区. 统计学处理：将各组织切片在统一的倍数下观察, 计算各组织切片新生软骨细胞、软骨基质及软骨岛的像素面积. 用KruskalWallis H 非参数检验(方差不齐)及多个独立样本两两比较的 Nemenyi 法检验，P0.05 为有统计学意义. 2 结果 2.1 动物的生存状况和存活率 各组实验犬术后存活均达到预杀期(12
16、wk)，均未发生切口感染等并发症. A 组实验犬在达到预杀期前略有呼吸困难，实验犬吠时可闻及喘鸣，B，C 组实验犬在达到预杀期前无呼吸困难，未闻及喘鸣. 2.2 大体改变 A 组标本气管环损伤处管壁有塌陷, 管腔明显狭窄，狭窄程度均超过 50%；B，C 组犬气损伤处管腔通畅，气管狭窄未超过 20%；各软骨缺损损伤处肉眼下均未见到新生软骨管环组织. 72.3 组织学表现 A 组缺损区可见纤维结缔组织填充，少量新生毛细血管生成，缺损区临近的气管环软骨组织部分软化吸收. B，C 两组缺损区纤维结缔组织内可见大量间充质细胞聚集，单位视野下新生毛细血管比 A 组多，植入区多见不成熟的新生软骨细胞聚集，有不均匀软骨基质形成，新生软骨主要为纤维软骨，也可见类似于气管软骨的新生透明软骨，其中 C 组软骨细胞形成多个软骨岛(图 2)，两组缺损区临近的软骨组织无软化
