天津大学,生物化学,课件第十二章4-5节-1

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1、第四节 RNA的生物合成 一 DNA指导下的RNA合成 转录 二 RNA指导下的RNA合成 RNA复制 三 RNA指导下的DNA合成 逆转录 一 DNA指导下的RNA合成 转录1 转录 在DNA指导下RNA的合成 此过程包括RNA链 的起始 延伸 终止等步骤 转录要涉及两方面 一是RNA合成的酶学过程 二 是RNA合成的起始信号和终止信号 模板链 转录的模板DNA链 也叫反义链或负链 编码链 与模板链对应的链 也叫有义链或正链 转录的起始是由DNA的启动子 promter 区控制 的 而控制终止的部位则称为终止子 ferminafor 一 DNA指导下的RNA合成 转录2 一 大肠杆菌RNA聚

2、合酶 二 RNA聚合酶催化的转录过程 三 RNA的转录后加工 一 大肠杆菌RNA聚合酶1 核心酶 一 大肠杆菌RNA聚合酶1 A A C C P T T P C C P GG A A P P P P OHOH 5 3 C C P GG P P P P OHOH U U DNA指导下的RNA合成 二 RNA聚合酶催化的转录过程 1 RNA聚合酶与模板DNA结合 2 起始 3 延伸 4 终止 1 RNA聚合酶与模板DNA结合1 RNA聚合酶结合到模板DNA的特定位置上 1 RNA聚合酶与模板DNA结合2 这一特定部位有RNA聚合作用的起动 基因 即启动子 TTGACA AACTGT TATAAT

3、ATATTA 35 识别位 10 Pribnow框 1 起始部位 DNA 5 3 原核生物启动子结构 1 RNA聚合酶与模板DNA结合3 双链DNA局部解开 2 起始1 磷酸二酯键的形成1 2 起始2 A A C C P T T P C C P GG A A P P P P OHOH 5 3 C C P GG P P P P OHOH U U 磷酸二酯键的形成2 3 延伸1 恢复的DNA 双螺旋 mRNA 5 延长阶段1 在DNA的一条链上 通过碱基配对 合成RNA链 解链区沿DNA移动 3 延伸2 延长阶段2 解链区到达基因终端 4 终止1 终止阶段1 RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落 4

4、 终止2 终止阶段2 原核生物转录中止信号及产物 AGCCCGC TCGGGCG GCGGGCT CGCCCGA TTTTTTTT AAAAAAAA 反义链 有义链DNA AAAAAAAA TTTTTTTT UUUUU U U C G G G C G G C C C G C A 5 反义链 有义链 DNA RNA产物 5 原核生物的转录过程 三 RNA的转录后加工 在细胞内 由RNA聚合酶合成的原初 转录物往往需要经过一系列的变化 包 括链的裂解 5 端与3 端的切除和特 殊结构的形成 碱基修饰和糖苷键的改 变 以及拼接等过程 使其能转变为成 熟的RNA分子 此过程总称为RNA的成熟 或转录后

5、加工 三 RNA的转录后加工 1 原核生物RNA的转录后加工 2 真核细胞RNA的转录后加工 1 原核生物RNA转录后加工1 mRNA 原核生物的mRNA大多不需加工 一经转 录即可直接进行翻译 1 原核生物RNA转录后加工2 rRNA1 大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位 它 们分散在基因组的各处 1 原核细胞RNA转录后加工2 rRNA2 P16SP23S P5S 16S23S 5S 细菌rRNA的形成 1 原核生物RNA转录后加工3 tRNA1 大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基 因约60个 这个数字远大于按变偶假说 所要求的反密码子数 即 某些反密码 子可能不只一个tRNA分子 或某些

6、tRNA 基因不是一个拷贝 tRNA基因大多成簇 存在 tRNA转录时首先成为tRNA前体 1 原核生物RNA转录后加工3 tRNA2 5 ppp 转录 tRNA前体 tRNA OH3 5 ppp OH3 OH3 核苷 酸降解产物 降解至单 核苷酸 p 成熟的tRNA U G m2G A i6A等 修饰 tRNA的形成 2 真核生物RNA转录后加工1 rRNA1 RNA聚合酶 的种类 功能所在 IrRNA的前体核仁 IImRNA的前体核质 III 5SrRNA tRNA 及其他多种 小分子核仁和核浆RNA前体 核质 2 真核生物RNA转录后加工2 rRNA2 18S5 8S28S 45S 甲基

7、化作用 核酸内切酶 18S RNA 5 8S RNA 28S RNA 真核生物rRNA前体的加工 2 真核生物RNA转录后加工3 rRNA3 真核生物rRNA的生成与成熟 45S 5S 41S 32S 5S 20S 32S 5S 细胞核 核仁 细胞质 28S 5 8S 18S 5S 28S 5 8S 18S 核蛋白体 2 真核生物RNA转录后加工4 tRNA1 在酶的催化下 切掉部分核苷酸分子 包 括14分子的UMP 7分子CMP 8分子GMP及少于1 分子的AMP tRNA前体分子被修饰 其一是有些尿嘧啶 残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基 其二 是甲基化作用 此变化是在甲基转移酶的催化 下

8、 由s 腺苷蛋氨酸供给甲基 在多核苷酸水 平上进行 从tRNA前体转变到tRNA的过程 2 真核生物RNA转录后加工5 tRNA2 tRNA的生成 细胞核 核仁 细胞质 tRNA基因 转录 5 切断 tRNA前体 nCH3 拟尿苷生成 tRNA 2 真核生物RNA转录后加工6 mRNA1 两者都为不均一分子 两者碱基组成上有部分相似 两者3 末端都有多聚腺苷酸尾部 5 端 连接有GMTP 7 甲基鸟苷 的帽子 1 细胞核中的不均一核RNA HnRNA 可能是mRNA的前体 因为 2 真核生物RNA转录后加工7 mRNA2 5 端形成特殊的帽子结构 M7G5 PPP5 NmpNp 在链的3 端切

9、断并加上多聚腺 苷酸 polyA 尾巴 通过拼接除去由内含子转录来 的序列 链内部核苷被甲基化 2 HnRNA转变成mRNA的加工过程 2 真核生物RNA转录后加工8 mRNA3 卵清蛋白基因产生mRNA的过程 转录 1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G 卵清蛋白基因 7700个核苷酸 1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G L L 5 3 加帽子和尾巴 1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G L 5 3 内含子RNA的除去 和拼接作用 12345 6 7 L CAPPolyA尾 成熟的mRNA 1872个核苷酸 2 真核生物RNA转录后加工9

10、 mRNA4 2 真核生物RNA转录后加工10 帽子结构形成过程 GTP Pi pppN1N2N3 G5 ppp5 N1N2N3 pppN1N2N3 RNA三磷酸酶 Pii mRNA鸟苷酸 转移酶 S 腺苷甲硫氨酸 m7G5 ppp5 N1N2N3 S 腺苷高半胱氨酸 mRNA 鸟嘌呤 7 甲基转移酶 mRNA 核苷 2 甲基转移酶 S 腺苷甲硫氨酸 S 腺苷高半胱氨酸 m7G5 ppp5 N1 mN2N3 S 腺苷甲硫氨酸 S 腺苷高半胱氨酸 m7G5 ppp5 N1 mN2mN3 mRNA 核苷 2 甲基转移酶 二 RNA指导下的RNA合成 RNA复制 病毒正链 具mRNA功能 pppG

11、5 3 OH 5 5 p p 3 OH 复制中间体 5 3 3 新合成的负链 病毒正链为模板 复制酶 5 三 依靠反转录的DNA生物合成1 1970年Temin和Baltimore同时分别从致癌RNA 病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶 由于它催化 遗传信息从RNA流向DNA 与转录作用正好相反 故称为反转录酶或逆转录酶 病毒感染细胞后 通过逆转录酶生成与病毒 RNA碱基序列互补的DNA 并整合到宿主细胞的 染色体DNA中 此后 在宿主细胞内 这段插 入的DNA经转录生成相应的mRNA 再转译成病 毒专一的蛋白质 三 依靠反转录的DNA生物合成2 RNA 3 5 依赖于RNA的DNA聚合酶 R

12、NA 3 5 核糖核酸酶H 5 3 5 3 cDNA 依赖DNA的DNA聚合酶 cDNA 杂种分子 3 5 5 3 双链DNA 新合成的双链DNA整合到 寄主染色体DNA中 第五节 基因的重组与DNA 克隆 DNA重组技术是指将不同的DNA片段按人们的 设计方案定向地连接起来 并在特定的受体细 胞中 与载体一起得到复制与表达 使受体细 胞获得新的遗传特性 从某种意义上来说 DNA重组技术也可理解为 基因工程 也是使生物基因结构得到改造的技 术 第五节 基因的重组与DNA 克隆 2 一 DNA重组技术的用途 二 重组中所用的酶和载体 三 重组的大致步骤 一 DNA重组技术的用途 1 利用DNA重

13、组技术大量生产一些在正常组 织代谢中产量很低的多肽物质 如多肽激素 多肽抗生素 酶类 抗体及各种肽类 2 定向地改造生物基因组结构 使其具有的 某些有经济价值的功能得以成百倍地提高 3 将DNA重组技术应用于基础研究 如在基 因组结构及基因组功能调节的研究 二 重组中的酶及载体 一 DNA体外重组中常用的酶 二 载体 一 DNA体外重组中常用的酶1 1 限制性内切酶 2 T4DNA连接酶 3 大肠杆菌 DNA聚合酶I 4 大肠杆菌DNA聚合酶大片段 klenow片段 5 T4DNA聚合酶 6 T4多核苷酸激酶 7 反转录酶 8 细菌碱性磷酯酶 9 核酸酶S1 10 脱氧核糖核酸酶I 11 po

14、lyA聚合酶 一 DNA体外重组中常用的酶2 由同一个限制性内切酶切断得到 的任何两个DNA片段的粘性末端都 可以互相配对 然后每条DNA链的 断开部分再通过DNA连接酶所产生 的磷酸二酯键连接起来 1 限制性内切酶1 一 DNA体外重组中常用的酶2 1 限制性内切酶2 酶 产生平头末端 限制和修饰部位来源 HindII 5 G T Py Pu A C 3 3 C A Pu Py T G 5 流感嗜血菌 HindI 5 G T T A A C 3 3 C A A T T G 5 副流感 嗜血菌 一 DNA体外重组中常用的酶2 酶 产生粘性末端 限制和修饰部位来源 EcoRI 5 G A A T

15、 T C 3 3 C T T A A G 5 流感嗜血菌 EcoRII 5 N C C N G G N 3 3 N G G N C C N 5 大肠杆菌 EcoRIII 5 A A G C T T 3 3 T T C G A A 5 流感嗜血菌 一 DNA体外重组中常用的酶2 1 限制性内切酶3 一 DNA体外重组中常用的酶3 2 T4DNA连接酶 是从噬菌体T4 感染过的大肠 杆菌中分离出来的 此酶由一条肽链组成 分子 量6800 催化DNA上的3 OH与5 P末端之间的 磷酸二酯键的形成 既可催化粘性末端又可催化 平头末端间的连接 催化过程需ATP和Mg2 3 大肠杆菌 DNA聚合酶I 5

16、 3 聚合酶活力 4 大肠杆菌DNA聚合酶大片段 klenow片段 将大肠杆菌DNA聚合酶用枯草杆菌素来降解 形成的产物中有一个分子量为76 000的多肽 即 为此酶 它失去了5 3 外切酶活力 其它功 能与DNA聚合酶相同 此酶用途很广 一 DNA体外重组中常用的酶4 5 T4DNA聚合酶 它存在于噬菌体T4中 与 klenow片段相似 5 3 聚合酶活力比大肠杆 菌DNA酶多200倍 6 T4多核苷酸激酶 此酶是从T4感染过的大肠 杆菌中分离出来的 它催化ATP上的 P转移到 DNA或RNA的5 OH上 所以可用来标记DNA或 RNA 7 反转录酶 合成cDNA的第一条链 具有5 3 DNA聚合酶活力 一 DNA体外重组中常用的酶5 8 细菌碱性磷酯酶 十分耐热 可将DNA或 RNA的5 P除去 反应常在600C以上进行 以 抑制反应中其他内切酶 9 核酸酶S1 催化单链DNA降解 产生5 P结尾的单核苷酸或寡核苷酸 用以切除双链 cDNA上的发夹形结构上的单链凸环 10 脱氧核糖核酸酶I 是一种内切酶 降 解双链或单链DNA 产生以5 P结尾的单核 苷酸及寡核苷酸的混合物 11

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