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1、三、常用色谱指纹谱实验技术 薄层色谱(TLC) 高效液相色谱(HPLC) 气相色谱(GC) 毛细管电泳(CE),（一）薄层色谱 1.概 述 快速、简单、灵敏鉴别、含量分析 器械、仪器、计算机化、自动化快速发展 指纹谱特点： 结果直观 离线操作的灵活性,2.薄层色谱操作规程,自动多次展开,全自动定量点样,薄层指纹图谱报告,简单操 作组合,供试品溶液制备,手工半定量点样,玻璃双槽展开箱展开,显色,直观观测(可见光及紫外光)判断样品指纹谱相似度,拍摄色谱图像照片记录,复杂操作组合,供试品溶液制备,计算机控制半自动或全自动定量点样,玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开,显色,直观观测(可见光及紫外光),
2、拍摄色谱图像照片记录,数码成像及数据处理,薄层扫描-积分数据,计算机相似度评价,3.薄层色谱的规范化 (1)器材的规范化 固液萃取小柱；定量微升毛细管；标准展开箱或双槽展开箱；预制薄层板；展开条件控制槽；紫外光灯；显色喷雾器或浸渍显色用玻璃缸；薄层色谱扫描仪。 半自动薄层点样器；计算机控制、参数可与薄层扫描仪共享的全自动薄层点样器；自动展开箱；薄层色谱成像及图像处理系统。,(2)操作规程的规范化 点样展开显色 (3)供试品溶液的预处理 “杂质”对待测的活性成分或指标成分形成干扰。不经预处理，很难得到清晰明确的结果。例 方法：A.加热回流 B.超声提取 C.液液萃取 D.固液萃取样品的提取液通过
3、固相小柱处理。吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。,如雪莲花, 甲醇提取液，不经净化处理，色谱的可见光或荧光图像与经预处理(18小柱洗脱)的图像比较，很显然经过预处理将杂质去除后色谱图像质量明显提高。,(4)展开溶剂的选择 展开剂薄层色谱的关键 展开剂优化依靠经验 展开剂要求分离度高，斑点多。 展开剂最优化模式难以计算： （1）样品中多类别成分共存，优化模式难以外延。 （2）溶剂蒸气在展开中起着举足轻重作用，但又难以获得可测量的参数。,鉴别判断信息多,(5)溶剂蒸气对色谱行为的影响 薄层色谱“开放”环境下展开，展开剂蒸气也参与展开全过程。 展开前蒸气预
4、平衡 调整蒸气浓度 保持展开溶剂新鲜度,改善色谱质量,黄 连溶剂系统：苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-28氨水(6：3：1.5：1.5：0.25，S1)。检测：置紫外光灯(365nm)下检视,图 黄连的荧光薄层色谱图1.巴马汀；2.小檗碱；3.表小檗碱；4.黄连碱；5、6.味连；7、8.雅连；9、10.云连；11、12.商品黄连；13.药根碱；14.非洲防己碱,S1中浓氨液的蒸气相在色谱中起了关键作用： A 仅用S1预平衡15min，氨蒸气量不足，药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均不能分开； B 改用浓氨水5ml在一侧槽中预平衡15min后展开，则药根碱+非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均得到分离；
5、C S1中除去浓氨水，仅用浓氨水预平衡，色谱分离度仍很差； D S1中浓氨水改为水，一侧槽中用浓氨水平衡，分离效果同B。,大 黄 游离蒽醌薄层色谱分析, 展开剂为石油醚(3060)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)，用新鲜开瓶的甲酸乙酯时，5种游离蒽醌分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酯时，由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或少分解而导致色谱的分离度大大降低。或配好的展开剂反复多次使用，各溶剂比例改变，色谱重现性差。,1.芦荟大黄素 2.大黄酸 3.大黄素 4.大黄素甲醚 5.大黄酚,(6)环境因素的影响 相对湿度分离度 （牛胆汁：RH72，四种分不开） 温 度分离度和Rf值 三七药材中的
6、三七皂苷R与人参皂苷Re只有在低温(10)才能分开。,实例人参类药材薄层色谱指纹图谱 1.试验材料及仪器 (1) 对照品 人参皂苷Ro、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rgl、Rg2、F2、伪人参皂苷F11、三七皂苷-Rl。 (2)薄层板 自制硅胶板；预制硅胶60F254板(20cm20cm)；高效板10cm10cm(Merck)。 (3)仪器 Nanomat-、-点样器及全自动点样器、双槽展开缸、VARIO-KS展开槽、HPTIC VARIO展开槽、薄层色谱条件控制槽、薄层扫描仪(均为瑞士CAMAG产品)、HP9482薄层色谱扫描软件、CATS薄层色谱扫描及评价软件(CAMA
7、G)、薄层色谱摄像仪(Reprostar，CAMAG)。,（4)试药 氯仿(精制、重蒸)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析纯)。 (5)供试品 吉林生晒参、吉林红参、新开河红参、三七、高丽红参、高丽白参、高丽曲参、美国西洋参、加拿大西洋参、国产引种西洋参。 2.样品预处理 (1)供试液1 样品+甲醇回流提取提取液 浓缩至近干水溶解 正丁醇萃取正丁醇液 减压蒸干五氧化二磷真空干燥器中干燥 总皂苷 加甲醇溶解，使成每1ml含总皂苷8mg(西洋参、三七为4mg)，作为供试液。,(2)供试液2 甲醇回流液适当浓缩碱性氧化铝小柱50甲醇洗脱洗脱液减压蒸干残渣加水溶解水溶液 Sep-Pak C18小柱甲醇洗脱
8、甲醇液蒸干 残渣甲醇溶解，使每1ml含8mg(人参总皂苷)或4mg(西洋参或三七总皂苷)，作为供试液。（除去人参皂苷Ro，特别因用预制板时，人参皂苷Ro与人参皂苷Rbl或Rb2重叠。） 3.点样 用微升毛细管分别吸取人参皂苷混合对照品甲醇液(4mgml)，人参、西洋参、三七供试液各1l，点样于硅胶板上，原点直径2mm或各吸取0.2l点样于高效板上，,原点直径18)、斑点相对位置重现性好(RSDB区C区；红参A区B区C区，D区的峰比生晒参更明显。,生晒参 红参 高丽参 西洋参,微观分析，西洋参色谱均呈一高(2-Rbl)一低(4-Rc)的二重峰，B区A区，一高(5-Re)一低(7-Rd)的二重峰(
9、林生参)或三重峰(5、6、7) ；C区特点是有8-Rgl、10-F11 、11-F2，无9-Rf 、12-Rg2；D区峰明显少而弱，比较稳定的是15号及17号弱峰。,西洋参,人参A区均呈四重峰(1-Ra、2-Rbl、3-Rb2+Rb3、4-Rc)；B区均为二重峰(5-Re 、7-Rd),无6号峰；C区有8-Rgl、9-Rf、12-Rg2，无10-F11、11-F2；D区较西洋参峰多而明显(1418号，微量皂苷), 未检出16号峰。 吉林红参D区的4、15号峰较明显，检出16号峰(可能是Rh)。 高丽红参样品中1418号峰较为明显而稳定。,高丽参,(3)个体分析 人参、西洋参所共有：Rbl、Rc、Rd、Re、Rgl。 人参特征：Ra、Rf、Rg2，无F11、F2； 西洋参特征：拟人参皂苷F11、F2，无Ra、Rb2、Rb3、Rf、Rg2； 红参特征：微量皂苷(D区)较生晒参高加工过程中主要人参皂苷部分水解而造成； 三七指纹图谱简单，主要是2号峰(Rbl)、5号+13号峰(Re+三七皂苷R1；未分开),
