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1、 临床分子生物学检验 第九章细菌感染的分子生物学检验方法 细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体 并在机体中生长繁殖 产生毒素或其他代谢产物所引起的全身性感染 临床上以寒战 高热 关节疼痛等为特征 部分患者还可以出现烦躁 四肢厥冷 发绀 呼吸加速 血压下降 感染性休克等临床症状 传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学 微生物学和血液学等相关技术 但这些技术方法受灵敏度和特异性的限制 不易达到早期诊断 利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 RNA或DNA 从而达到早期 快速 敏感 特异地检测已经成为临床检验的主流技术之一 第一节细菌感染的分子生物学检验策略 分子生物学检验是以核酸
2、DNA或RNA 或蛋白质分子为检验目标 通过检查人体内源基因或外源 病原体 基因的存在 缺陷或表达异常 对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程 机体感染细菌后 应用分子生物学技术直接测定这些细菌病原体基因 不仅可以对微生物感染作出明确诊断 同时也能诊断出带菌者或潜在性感染 还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测 一 细菌感染的一般性检出策略细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列 利用分子生物学技术对目标序列进行检测 从而直接判断有无细菌感染和是何种病原体感染 二 细菌感染的完整性检出策略完整性检出策略 即不仅对病原体作出快速准确诊断 还需要对
3、其进行分型 包括亚型 和耐药性等方面的检测 尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原体的相关信息 第二节结核分枝杆菌的分子生物学检验 结核分枝杆菌 TB 简称结核杆菌 是引起结核病的病原体 随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善 结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降 近年 由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现 免疫抑制剂的应用 吸毒 贫困及人口广泛流动等因素 全球范围内结核病的疫情死灰复燃 据WHO统计 全世界约1 3的人感染了结核分枝杆菌 在某些发展中国家成年人中群中结核分枝杆菌携带率高达80 其中的5 10 携带者可发展为活动性结核病 TB是一种革兰氏阳性菌 G C含量高 其细胞壁除
4、肽聚糖层外 还含有另外一层由特殊脂质 糖脂和多糖组成的附加层 TB呈细长略弯曲 常聚集成团 用抗酸性染色被染成红色 对养要培求特殊条件 一般要经4 6周才出现肉眼可见的菌落 TB通过呼吸道 消化道和破损的皮肤粘膜侵入机体 它被吞噬后能在吞噬细胞内繁殖 导致巨噬细胞裂解 还可在细胞外繁殖 TB的培养特点 馋 懒 丑 馋 营养要求较高 必须在含血清 卵黄 马铃薯 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基 罗氏 上才能生长良好 懒 生长缓慢 14 18h分裂1次 在固体培养基上2 5w才出现肉眼可见的菌落 丑 典型菌落为粗糙型 表面干燥呈颗粒状 不透明 乳白色或淡黄色 如菜花样 TB具有合成所有必需氨基酸
5、 维生素和酶辅助因子的潜在能力 该菌具有代谢各种各样碳水化合物 乙醇 酮和羧酸的能力 此外 还具有许多涉及脂代谢 糖酵解 磷酸戊糖途径 三羧酸和乙醛酸循环所必须的酶分子 结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力 使得治疗极其困难 该菌的药物抵抗力主要由于其具有高度疏水的细胞壁充当渗透屏障 同时 在基因组中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列 包括水解酶或者药物修饰酶 例如乙酰转移酶和很多药物外排泵系统 抵抗力特点 三耐四敏 耐干燥 耐酸碱 耐孔雀绿 1 13000 对湿热 70 乙醇 紫外线 常用抗结核药物 但长期使用易产生耐药性 变异性 典型形态 多形性 R型菌落 S型菌落 有毒 无毒 用于
6、制备疫苗 抗结核药敏感 耐药 目前结核杆菌常规检测方法 痰涂片法阳性率低 且易受非结核杆菌的污染 培养法目前认为是诊断的 金标准 但结核杆菌生长缓慢 不利于临床上的及时诊断和治疗 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉 特异性不强 TBH37Rv全基因组为环状双链DNA 长约4411529bp 共有4000基因 G C平均值65 6 其基因序列高度保守 H37Rv基因组中有50个编码功能RNA的基因 其中45个tRNA基因 3个rRNA基因和2个核稳定 stable RNA基因 这些RNA分子是由特异的核糖体RNA操纵子产生的 一 结核分枝杆菌的基因组结构特征 在H37Rv全基因组
7、中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个拷贝的IS1018 大多数插入序列位于基因间或非编码区 通常靠近tRNA基因聚集成串 插入序列在染色体中主要分布在重复区 TBH37Rv基因组中共有3924个开放阅读框 其中91 有潜在的编码能力 ORF中最常见的起始密码子61 为ATG 35 为GTG 187个ORF参与脂类代谢 细胞壁合成 360个参与细胞壁代谢 66个参与脂类合成 287个参与能量代谢 95个参与氨基酸合成 38个与细菌毒力相关 69个参与DNA合成 所编码的蛋白约有40 的为功能性蛋白 44 的与已知蛋白有相似性信息 16 的则为未知蛋白 TB不同菌株之间存在多个差异基因 基因
8、组中有3个毒力因子 mce 过氧化氢酶 过氧化物酶和sigA 除了这些单基因毒力因子 细菌的胞壁也对致病性起着重要的作用 二 结核分枝杆菌的分子生物学检验内容 一 结核分枝杆菌核酸的检测可采用PCR real timePCR PCR RFLP 线性探针杂交 链替代扩增技术 扩增结核分枝杆菌直接试验 基因芯片技术 全自动结核检测平台等方法检测标本中的TBDNA 1 PCRPCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因 MPB蛋白基因 rRNA基因 TBIS6110插入序列 染色体DNA的重复序列等 常规PCR的不足 产物的交叉污染 假阳性 假阴性 实验室污染 2 real timePCR与传统PCR
9、相比 具有敏感度 特异性高及方便快速等优点 特别是对难以培养与生长缓慢的结核杆菌的检测更有优势 3 PCR RFLP通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段DNA 将扩增产物经限制性内切酶消化 最常用的内切酶是Pvu 将消化的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析 不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同 电泳图谱呈现多态性 4 线性探针杂交其原理是应用生物素标记的特异引物进行靶核酸的扩增 将产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针杂交 通过酶免疫显色法显示结果 一次杂交可以检测多种靶序列 简便 快速 敏感 5 链替代扩增技术 SDA SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术 基本原理 引物与靶DN
10、A序列上对应的DNA单链杂交 在聚合酶作用下产生带Hinc 识别位点含5 和3 端的靶DNA序列 该靶序列进入DSA循环 Hinc 限制性核酸内切酶切割识别位点 依赖DNA聚合酶在切割处延伸3 端 并替代另一条DNA链 该替代链与引物杂交后又依次作为另一扩增反应的靶源 这些步骤在反应体系中不断重复 使靶DNA序列呈指数性增长 37 40 进行23次循环后 2h内靶序列可得到108扩增放大 SDA法以IS6110和16SrRNA基因为扩增靶点 6 扩增结核分枝杆菌直接试验 AMTDT AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板 采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增 采用化学发光物吖啶酯
11、标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂交 探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去未杂交的标记探针 最后利用化学发光仪检测化学发光信号 AMTDT方法具有高度的敏感性特异性 对涂片阳性TB诊断的敏感性达到92 100 对所有临床标本检测的特异性均在95 以上 因此具有极大的临床应用价值 7 基因芯片技术 1999年Troesch等开发出首块结核病相关芯片 包括两部分 一部分是在结核分枝杆菌有种间的多态性的16SrRNA基因片段 借以鉴别结核杆菌与非结核杆菌 另一部分则用于分析耐利福平菌株rpoB基因突变的发生情况 可用于结核分枝杆菌对利福平耐药性的快速检测 8 GeneXpert全自动结核检测平台
12、将样品前处理 核酸提取 PCR检测和结果分析等全过程结合在一起 最大程度上提高检测自动化和灵敏度 XpertMTB RIF 通过六重荧光定量PCR对结核分枝杆菌和利福平耐药性进行快速检测 二 结核分枝杆菌的耐药性检测结核分枝杆菌耐药的分子机制是由于结核杆菌的特定基因某些碱基出现突变 插入 缺失 替换 而造成 1 结核分枝杆菌的耐药机制 1 耐利福平分子机制 是由于其作用靶标 结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶 亚单位的编码基因 rpoB 突变所致 当rpoB中507 533位密码子的核心区域 耐利福平决定区 RRDR 发生突变时 使DNA依赖RNA聚合酶 亚单位酶结构改变利福平不能与细菌的RNA聚
13、合酶 亚单位结合而表现为耐药 其中以编码531位氨基酸的碱基TCG TTG和编码526位氨基酸的碱基CAC TAC的突变最常见 2 耐异烟肼分子机制 结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢酶 过氧化物酶编码基因 katG 烯酰基还原酶编码基因 inhA 烷基过氧化氢酶还原酶编码基因 ahpC 2S酮酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因 kasA 有关 主要是katG基因的点突变 缺失 插入 完全缺失占异烟肼耐药菌株的7 24 主要出现于高水平耐异烟肼分离株中 随机突变占50 70 常见的点突变是315位AGC ACC和463位CGG CTG inhA基因突变约占异烟肼临床耐药株的10 35 耐药的发生可由于in
14、hA结构基因突变造成异烟肼与DADH的亲和力下降 或是inhA启动子 15的C T的点突变可能创造一个强有力的启动 使inhA蛋白过度表达从而提高对异烟肼活性形式所需的浓度 引起对异烟肼耐药 inhA基因的突变常出现低水平异烟肼耐药性 3 耐氨基糖苷类药物分子机制 耐链霉菌的结核杆菌主要由于编码核算糖体16SrRNA的rrs基因与编码核糖体蛋白S12的rpsL基因发生突变 从而降低了氨基糖苷类药物结合到核糖体上的能力 形成耐药 rpsL基因中编码第43位氨基酸的碱基A G的突变是常见的突变位点出 Rrs基因突变点为512 513位的碱基插入 这些碱基突变均可导致高水平的耐药 4 耐吡嗪酰胺分子
15、机制 吡嗪酰胺需经结核分枝杆菌体内的吡嗪酰胺酶催化才能转变成具有活性的吡嗪酸 耐吡嗪酰胺主要由pncA基因突变所造成的吡嗪酰酶的蛋白结构改变 失去了将吡嗪酰胺转换成活性形式的能力 形成耐药 5 耐乙胺丁醇分子机制 耐乙胺丁醇主要与操纵子cmbB基因有关 cmbB突变导致糖基转移酶结构 影响乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药 其中第306位密码子的错义突变最为常见 6 耐氟喹诺酮类药物分子机制 氟喹诺酮类药物主要靶位是结核杆菌的DNA旋转酶 该酶由gyrA和gyrB两种基因编码的两个A亚单位和两个 亚单位组成 其中编码的gyrA基因发生突变则导致氟喹诺酮类药物结合位点构象改变 从而产生耐药性
16、突变大多数发生在gyrA基因保守区67 106位密码子区 常见有94位GAC GCC或CAC或TAC 90位GCC GTG的突变 2 结核分枝杆菌耐药性检测的分子生物学技术 1 DNA测序 该技术是检测基因突变的金标准 不仅可用于突变的筛选 而且能确定突变碱基的部位和分布 2 PCR SSCP 3 PCR RFLP 4 PCR ROB 5 基因芯片技术 三 分子生物学检验的临床意义 传统的结核病的临床诊断主要是根据病史 细菌培养 涂片抗酸染色找TB 免疫学方法检测TB抗原或抗体 胸片等可对大多数患者做出正确的临床诊断 但对部分病人可造成误诊或漏诊 分子生物学方法为TB的临床诊断提供了一种快速 准确的诊断方法 具有以下特点 1 在TB感染早期 特别是在TB病灶通过血源性外传播时及在外周血中存在极少量的TB时 分子生物学方法能通过体外扩增进行确诊 而早期诊断在临床诊疗中具有重要的指导意义 可以防止继发性TB病灶的形成 2 PCR检测TB仅需2 4小时 克服了传统TB培养方法需时间长 痰涂片检查阳性率低的缺点 提高了临床检测的敏感性和特异性 3 可以通过分子生物学技术进行结核耐药的早期快速检
