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1、 第七章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography HPLC 液相色谱仪 1 液相色谱仪 2 液相色谱仪 3 生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混 合物 所含成分在一万种以上 其分子量从18到几百万 而 且其中有意义的化学成分的含量又往往很低 因此 必须要 有一种高分辨 高灵敏度的分离鉴定手段 气相色谱和高压 液相色谱具有以上特点 它们可通过对生物样品和生物体液 样品的有关成分的提取 分离 分析定量 进行对疾病的早 期快速诊断的研究等 高压液相色谱对于挥发性低 热稳定性差 分子量大的高 分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利
2、如氨基酸 多肽 蛋白质 生物碱 核酸 甾体 类脂 维生素 抗菌 素等均可进行分离分析定量 尤其是高灵敏度方面 可以检测出10 9 10 12克的痕量物 质 能达到这个检测量的分析方法并不多见 第一节 高效液相色谱法概述 一 理论基础 速率理论 A为涡流扩散项 B u分子扩散项 Cu项即传质阻力项 二 HPLC技术 采用高压输液泵 高效微粒固定相和高采用高压输液泵 高效微粒固定相和高 灵敏度检测器 灵敏度检测器 三 HPLC特点 高压 高速 高效 高灵敏度 样品回 收方便 经典LC与HPLC比较 经典经典LCLCHPLCHPLC 柱之内径柱之内径1 5cm1 5cm 0 4cm 0 4cm 长度
3、长度50 100cm50 100cm15 50cm15 50cm 填充材料粒度填充材料粒度150 m 200 m 150 m 200 m 4 m 10 m4 m 10 m 使用压力使用压力1 10atm1 10atm50 200atm50 200atm 分离时间分离时间0 5h 0 5h 天天 10min 10min 与气相色谱法比较 HPLC的优点 分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化 合物 HPLC不受样品挥发性和热稳定性 的限制 适用于高沸点 热稳定性差 摩 尔质量大的物质 原则上讲 几乎可以分 析除永久气体外所有的有机和无机化合物 流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运
4、载作用 对 组分不产生相互作用力 HPLC的流动相对 组分产生相互作用力 相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行 缺点 仪器设备费用昂贵 操作严格 第二节 HPLC的主要类型 一 液一液分配色谱法 LLPC 在液 液色谱中 流动相和固定相都是 液体 它能适用于各种样品类型的分离和分 析 无论是极性的和非极性的 水溶性和油 溶性的 离子型的和非离子型的化合物 1 分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液 萃取相同 都是根据物质在两种互不相溶 的液体中溶解度的不同 具有不同的分配 系数 所不同的是液液色谱的分配是在柱 中进行的 使这种分配
5、平衡可反复多次进 行 造成各组分的差速迁移 提高了分离 效率 从而能分离各种复杂组分 2 固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液 组成 常用的载体有下列几类 1 全多孔型载体 由硅胶 硅藻土等 材料制成 直径约100 m的全多孔型颗 粒 这类固定相由于颗粒很细 孔仍然 较浅 传质速率快 易实现高效 高速 特别适合复杂混合物分离及痕量分析 2 表面多孔型载体 薄壳型微珠载体 由直径为30 40 m的实心玻璃球和 厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成 目前 这种载体粒度为5 10 m 这类固定相的多孔层厚度小 孔浅 相 对死体积小 出峰迅速 柱效亦高 颗粒较大 渗透性好 装柱容易 梯度淋洗时能迅速
6、达 平衡 较适合做常规分析 由于多孔层厚度薄 最大允许量受限制 化学键合固定相 它是将各种不同有机基 团通过化学反应键合到载体表面的一种方法 它代替了固定液的机械涂渍 因此它的产 生对液相色谱法迅速发展起着重大作用 可以 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破 它是目前应用最广泛的一种固定相 据统计 约有3 4以上的分离问题是在化学 键合固定相上进行的 3 流动相 根据所使用的流动相和固定相的极性程 度 将其分为正相分配色谱和反相分配色谱 正相分配色谱 流动相的极性小于固定相的极性 它适用于极性化合物的分离 其 流出顺序是极性小的先流出 极 性大的后流出 反相分配色谱 流动相的极性大于固定相的
7、极性 它适用于非极性化合物的分离 其流出顺序与正相色谱恰好相反 二 液一固吸附色谱法 LSAC 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作 为固定相 吸附剂通常是些多孔的固体 颗粒物质 在它们的表面存在吸附中心 液固色谱实质是根据物质在固定相上 的吸附作用不同来进行分离的 1 分离原理 当流动相通过固定相 吸附剂 时 吸附剂 表面的活性中心就要吸附流动相分子 同时 当 试样分子 X 被流动相带入柱内 只要它们在 固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已 被吸附的流动相溶剂分用 于是 在固定相表面 发生竞争吸附 X nSad Xad nS 达平衡时 有 其中Kad为吸附平衡常数 值大表示组分在吸附剂 上保
8、留强 难于洗脱 Kad值小 则保留值弱 易 于洗脱 试样中各组分据此得以分离 Kad值可通 过吸附等温线数据求出 2 固定相 液 固吸附色谱所用固定相多是一些 吸附活性强弱不等的吸附剂 如硅胶 氧 化铝 聚酸胶等 由于硅胶的优点较多 如线性容量较高 机械性能好 不溶胀 与大多数试样不发生化学反应等 因此 以硅胶用得最多 目前最广泛使用的还是5 10 m的全 多孔型微粒填料 3 流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用 极性强的洗脱剂 对极性弱的试样宜用极 性弱的洗脱剂 三 离子交换色谱法 IEC 此法是利用离子交换原理和液相色谱技 术的结合来测定溶液中阳离子
9、和阴离子的一 种分离分析方法 凡在溶液中能够电离的物 质 通常都可用离子交换色谱法进行分离 它不仅适用无机离子混合物的分离 亦可用 于有机物的分离 例如氨基酸 核酸 蛋白 质等生物大分子 因此 应用范围较广 1 离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对 固定相亲和力的差别来实现分离的 其固定 相采用离子交换树脂 树脂上分布有固定的 带电荷基团和可游离的平衡离子 当待分析 物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的 平衡离子进行可逆交换 其交换反应通式如 下 阳离子交换 阴离子交换 一般形式 R一A B R B A 达平衡时 以浓度表示的平衡常数 离子交换反应 的选择系数 式中 A r B
10、r 分别代表树脂相中洗脱剂离子 A 和试样离子 B 的浓度 A B 则代表它 们在溶液中的浓度 KB A越大 说明B离子交换能力越大 越易保 留而难于洗脱 一般说来 B离子电荷越大 水 合离子半径越小 KB A值就越大 2 固定相 l 多孔型离子交换树脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联 聚合物 直径约为5 20 m 有微孔型和大 孔型之分 2 薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对 30 m的固体惰性核上 凝聚1 2 m厚的树脂层 3 表面多孔型离子交换树 脂 它是在固体情性核上 覆盖一层微球硅 胶 再在上面涂一层很薄的离子交换树 脂 4 离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合
11、到惰性载体表面 它也分为两种类型 一 种是键合薄壳型 其载体是薄壳玻珠 另 一种是键合微粒载体型 它的载体是多孔 微粒硅胶 后者是一种优良的离子交换固 定相 它的优点是机械性能稳定 可使用 小粒度固定相和高柱压来实现快速分离 3 流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定 pH和盐浓度 或离子强度 的缓冲溶液 通 过改变流动相中盐离子的种类 浓度和pH值 可控制k值 改变选择性 有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同 水缓冲溶液混合使用 以提高特殊的选择 性 并改善样品的溶解度 盐离子的浓度影响 如果增加盐离子的浓度 则可降低样品 离子的竞争吸附能力 从而降低其在固定相 上的保留值 要视不同情况而定
12、 例如 分离有机酸 和有机碱时 这些酸碱的离解程度可通过改 变流动相的pH值来控制 增大pH值会使酸的 电离度增加 使碱的电离度减少 降低PH值 其结果相反 但无论属于哪种情况 只要 电离度增大 就会使样品的保留增大 pH值的影响 四 离子对色谱法 IPC 离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机 碱的极好方法 离子对色谱法是将一种 或数种 与溶质离子 电荷相反的离子 称对离子或反离子 加到流动相 或固定相中 使其与溶质离子结合形成离子对 从 而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 假如有一离子对色谱体系 固定相为非极性 键合相 流动相为水溶液 并在其中加入一种电 荷与组分离子A 相反的离子B B
13、 离子由于静电 引力与带负电的A 组分离子生成离子对化合物A B 离子对生成反应式 由于离子对化合物A B 具有疏水性 因而被非极性固定相 有机相 提取 组 分离子的性质不同 它与反离子形成离子 对的能力大小不同以及形成的离子对流水 性质不同 导致各组分离子在固定相中滞 留时间不同 因而出峰先后不同 这就是 离子对色谱法分离的基本原理 流动相 加有平衡离子 反离子 的极性 溶液通过改变流动相的pH 平 衡离子的浓度和种类可改变分离 的选择性 固定相 非极性的疏水键合相 五 离子色谱法 IC 抑制型 抑制柱型 连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在 0 01 0 05毫摩尔 克干树脂
14、非抑制型 当进一步降低分离柱中树脂的交换容 量 0 007 0 07毫摩尔 克干树脂 使用低浓度 低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液 如苯 甲酸 苯甲酸盐等 检测器可直接与分离柱相连 不需抑制柱 离子色谱装置类型离子色谱装置类型 离子色谱连续抑制装置图 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景 电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导 检测器可直接检测各种离子的含量 若样品为阳离子 用无机酸作流动相 抑制柱为高 容量的强碱性阴离子交换剂 当试样经阳离子交换剂的 分离往后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个 重要反应 R OH H Cl R Cl十H2O R 一OH M Cl M
15、 OH R Cl 由反应可见 经抑制柱后 一方面将大量酸转 变为电导很小的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子M 转变成相应的碱 由 于OH 离子的浓度为Cl 离子的2 6倍 提高了所测 阳离子电导的检测灵敏度 对于阴离子样品也有相 似的作用机理 离子色谱的应用 阴离子分析 双柱 薄壳型阴离子交换树脂分离柱 3 250mm 流动相 0 003mol L 1 NaHCO3 0 0024 mol L 1 Na2CO3 流量138 mL hr 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离 各组 分含量在3 50 ppm 六 空间排阻色谱法 SEC 主要用于较大分子的分离 与其他液相色谱
16、方法原理不同 它不具有吸附 分配和离子交换 作用机理 而是基于试样分子的尺寸和形状不同 来实现分离的 1 固定相 排阻色谱固定相种类很多 一般可分为软 性 半刚性和刚性凝胶三类 所谓凝胶 指含有大量液体 一般是水 的 柔软而富于弹性的物质 它是一种经过交联而具 有立体网状结构的多聚体 1 软性凝胶 如葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶都具有较小的 交联结构 其微孔能吸入大量的溶剂 并能溶胀到它们干 体的许多倍 它们适用以水溶性溶剂作流动相 一般用于 小分子质量物质的分析 不适宜用在高效液相色谱中 2 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯 Styragel 比软性凝胶稍耐压 溶胀性不如软性 凝胶 常以有机溶剂作流动相 用于高效液相 色谱时 流速不宜大 3 刚性凝胶 如多孔硅胶 多孔玻璃等它们既 可用水溶性溶剂 又可用有机溶剂作流动相 可 在较高压强和较高流速下操作 一般控制压强小 于7MPa 流速 1cm3 s 1 否则将影响凝胶孔径 造成不良分离 2 流动相 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品 并必须与凝胶本身非常相似 这样才能润湿凝胶 当采用软性凝胶时 溶剂也必须能溶胀凝胶 溶剂的粘度要小 因为高
