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1、ICS07.100.99B 41DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/ XXXXXXXXX动物垫料中金黄色葡萄球菌检测方法Detection method for staphylococcus aureus in animal bedding点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、呼和浩特国际旅行卫生保健中心、二连浩特海关。本标
2、准主要起草人：赵治国、陈林军、韩祎陟、崔强、敖威华、延涵、王海艳、杨帆、盛万里、马彩霞。8动物垫料中金黄色葡萄球菌检测方法1 范围本标准规定了动物垫料中金黄色葡萄球菌的定性检测方法。本标准适用于动物垫料中金黄色葡萄球菌定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则SN/T 1538.1 培养基制备
3、指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1动物垫料 animal bedding用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。4 设备和材料4.1 冰箱：2 5。4.2 恒温培养箱：36 1 。4.3 均质器。4.4 振荡器。4.5 电子天平：感量0.1 g。4.6 全自动微生物生化鉴定系统。4.7 飞行时间质谱仪。4.8 二级生物安全柜。4.9 pH 计。4.10 高压蒸汽灭菌器。4.11 无菌锥形瓶：容量500 mL，25
4、0 mL。4.12 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。4.13 无菌培养皿：15 mm90 mm。4.14 无菌试管：18 mm180 mm、13 mm130 mm。4.15 无菌棉签。4.16 无菌镊子。4.17 无菌剪刀。4.18 无菌勺。4.19 无菌玻片。4.20 无菌接种环。5 培养基和试剂5.1 生理盐水：见A.2。5.2 磷酸盐缓冲液(PBS)：见A.3。5.3 7.5%氯化钠肉汤：见A.4。5.4 Baird-Parker平板：见A.5。5.5 血琼脂平板：见A.6。5.6 金黄色葡萄球菌显色培养基。5.7 脑心浸出
5、液肉汤(BHI)：见A.7。5.8 兔血浆：见A.8。5.9 营养琼脂小斜面：见A.9。5.10 革兰氏染液。5.11 革兰氏阳性菌生化鉴定卡。5.12 飞行质谱仪靶板。5.13 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 13311，或等效菌株。5.14 大肠杆菌标准菌株CMCC 44102，或等效菌株。6 检验程序金黄色葡萄球菌检验程序见图1。样品制备检样25g或25cm2检液+7.5%氯化钠肉汤 361培养18 h24 h Baird Parker平板 血琼脂平板（或金黄色葡萄球菌显色培养基） 361培养24 h48 h 361培养18 h24 h 挑取纯培养的可疑菌落 361培养18 h24 h全
6、自动微生物鉴定系统 BHI肉汤和营养琼脂小斜面 染色镜检 观察溶血 血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌 非金黄色葡萄球菌报告图1 金黄色葡萄球菌检验程序7 操作步骤7.1 采样7.1.1 采样原则样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。7.1.2 颗粒状或粉末样品对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉末状垫料样品，加入225 mL 7.5 %氯化钠肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养18 h 24 h进行预增菌。7.1.3 平面样品无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面
7、垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复取样14个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1 mL原液对应的样品面积为1 cm2）。取25 mL样品原液加入225 mL 7.5 %氯化钠肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置36 1 培养18 h 24 h进行预增菌。表1 不同面积平面类垫料样品采样量样品面积m2采样量cm2规格板数小于0.25
8、（含）2510.250.5（含）5020.50.75（含）753大于0.7510047.2 分离培养将增菌后的培养物，分别划线接种于Baird-Parker平板和血琼脂平板（或金黄色葡萄球菌显色平板），于36 1 培养，其中Baird-Parker平板培养24 h48 h，血琼脂平板和金黄色葡萄球菌显色平板培养18 h24 h；分别观察各个平板上生长的菌落，根据菌落形态初步判定典型和可疑菌落，金黄色葡萄球菌在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表2。表2 金黄色葡萄球菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板金黄色葡萄球菌菌落形态Baird-Parker平板菌落为圆形，光滑、凸起、湿润，颜
9、色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。血琼脂平板菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。金黄色葡萄球菌显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。根据菌落形态挑取至少5个典型或可疑菌落（少于5个时，全部挑取），划线接种于营养琼脂平皿，361培养18 h24 h。7.3 鉴定7.3.1 染色镜检挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5 m1 m。7.3.2 血浆凝固酶试验挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选)，分别接种到5 m
10、L BHI和营养琼脂小斜面，361培养18 h24 h。取新鲜配制兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，361培养18 h48 h，重复试验。7.3.3 辅助设备鉴定可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等对
11、典型或可疑菌落进行鉴定，具体操作依据相关标准。8 结果与报告8.1 凡经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并且血浆凝固酶试验阳性者；或全自动生化鉴定系统/飞行质谱仪鉴定为金黄色葡萄球菌，则报告动物垫料样品中检出金黄色葡萄球菌。8.2 结果报告:在25 g(cm2)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。9 生物安全措施为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489的有关规定执行。10 废弃物处理和防治污染的措施检测过程中的废弃物需经121高压灭菌处理至少30 min后再弃置。附录A （资料性附录）培养基和试剂A.1 培养基制备及质量保证按照S
12、N/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2 生理盐水A.2.1 成分氯化钠 8.5 g 蒸馏水加至 1000 mL A.2.2 制法溶解后，高压灭菌121 ，20 min。A.3 磷酸盐缓冲液(PBS)A.3.1 成分磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g蒸馏水 500 mLA.3.2 制法贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 至7.2，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。A.4 7.5 %氯化钠肉汤 A.4.1 成分蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 75.0 g 蒸馏水
