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1、多糖的研究方法及其现状 活性多糖的研究 正在形成中的热点 方积年 中国科学院上海药物研究所 2004 11 生命的四大物质 蛋白质 核酸 脂类 多糖 六十年代以后 随着现代仪器 分析方法的飞速发展 使人们能成 功的分离纯化和鉴定生物体内微量 活性物质 从而对糖特别是多糖的 认识产生了飞跃 愈来愈多的研究发现 人的生命过程几 乎都与糖链有关 如 细胞间通讯 识别和相互作用 细胞的运动和粘附 病原与宿主细胞的作用 等等 这是因为糖链携带着生物信息 它在细 胞表面的分子识别过程中起着决定性作用 血型 红血球表面糖链末端糖基的不同 恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同 糖链的不同 1995年Hirabayas
2、hi提出 类似于基因密码 可能 也存在多糖密码 的论点 多糖的研究己愈来愈受到人们的关注 国内外正在形成热点 生物细胞 特征 繁殖 复制 凋亡 平衡 平衡破坏 细胞过度增生 组织表 面大体积堆积 肿瘤 增生 细胞基因突变 癌 癌细胞源于正常细胞 找既抑制癌细胞又不 伤正常细胞 困难 多糖是一种免疫调节剂 激活机体免疫反应 但也有少数多糖具直接杀死癌细胞作用 或两者俱存 治疗机体免疫功能受到严重损伤的癌症 和爱滋病 治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌 病毒 引起的疾病 多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小 多糖还具有明显的抗病毒 抗感染 降 血糖 降胆固醇 降血脂以及最近我们实验室 发现的刺激神经细
3、胞生长作用 徐 冯教授 抗心肌缺血作用 但是 多糖的研究必竟起步较晚 各方面尚须进行深入的研究 大量新的活性多糖有待于研究与开发 作用机制有待于完善 多糖的构效关系的研究是寻找高活性 多糖及深入研究多糖作用机制的基础 最近最近 作用机理研究作用机理研究 进展快进展快 机体机体 免疫细胞免疫细胞 多糖多糖 分子水平分子水平 激活激活 释放出细胞间传导的信息释放出细胞间传导的信息CytokineCytokine 再作用于免疫细胞再作用于免疫细胞 体内协同作用体内协同作用 最终最终 抑制肿瘤生长抑制肿瘤生长 多糖在机体免疫反应中相当于多糖在机体免疫反应中相当于抗原抗原 免疫细胞可识别多糖免疫细胞可识
4、别多糖 迅速被多糖诱导激活产生免疫反应迅速被多糖诱导激活产生免疫反应 多糖作用机理研究集中于多糖作用机理研究集中于 1 1 多糖与免疫细胞是否有分子水平接触多糖与免疫细胞是否有分子水平接触 2 2 怎样接触怎样接触 免疫细胞表面是否存在识别免疫细胞表面是否存在识别 多糖的受体多糖的受体 3 3 免疫细胞激活后如何协同作用杀死癌细胞免疫细胞激活后如何协同作用杀死癌细胞 研究至今研究至今 有的已阐明有的已阐明 如如 发现发现 Glucan Glucan与免疫细胞与免疫细胞 单细胞单细胞 巨噬细胞巨噬细胞 中性粒细胞中性粒细胞 自然杀伤细胞自然杀伤细胞 发生特异性结合发生特异性结合 活活 化信号传导
5、途径化信号传导途径 调节细胞因子释放调节细胞因子释放 19971997发现人体单细胞表面的受体发现人体单细胞表面的受体 多糖对机体作用后多糖对机体作用后 细胞因子细胞因子 TNF IL 1 2 TNF IL 1 2 浓度浓度 显著显著 正在深入研究中正在深入研究中 D 1 D 1 3 Glucan 3 Glucan 抗肿瘤抗肿瘤 水溶水溶 水不溶水不溶 不同立体结构不同立体结构 单螺旋单螺旋 三螺旋三螺旋 无规线团无规线团 半柔顺链半柔顺链 聚集体聚集体 不同构象不同构象 不同活性不同活性 由于细胞表面受体蛋白具特定构象由于细胞表面受体蛋白具特定构象 只识别只识别 特殊构象多糖特殊构象多糖 杂
6、多糖杂多糖 糖蛋白糖蛋白 D 1 D 1 3 Glucan3 Glucan 显著抗肿瘤显著抗肿瘤 阐明阐明 多糖多糖 靶细胞上受体靶细胞上受体 分子水平药物设计分子水平药物设计 重要指导意义重要指导意义 多糖多糖 分子内及分子间分子内及分子间 较强氢键作用较强氢键作用 不溶于水不溶于水 影响活性影响活性 大量实验表明大量实验表明 衍生化衍生化 水溶性提高水溶性提高 活性提高活性提高 近代研究另一热点近代研究另一热点 多糖衍生化两种方法多糖衍生化两种方法 1 1 不溶性多糖不溶性多糖 水解水解 醇解醇解 酶解酶解 如如 碱不溶性多糖碱不溶性多糖 Glucan Glucan 与甲壳素复合物与甲壳素
7、复合物 甲甲 壳素酶解去甲壳素壳素酶解去甲壳素 水溶水溶 甲酸解甲酸解 多糖多糖 99 HCOOH 99 HCOOH降解降解 99 EtOH 99 EtOH沉淀沉淀 溶溶 解解 透析透析 冻干冻干 formalated derivatives formalated derivatives Smith Smith降解降解 pH3 5pH3 5水溶液水溶液 0 1M NaIO4 0 1M NaIO4 氧化氧化 NaBH4 NaBH4 还原还原 部分酸水解部分酸水解 Polyalcohols Polyalcohols 2 2 半合成方法半合成方法 衍生化基团取代衍生化基团取代 多糖中羟基中多糖中羟基
8、中H H 原原 子子 改变氢键作用改变氢键作用 成盐成盐 改善溶解性改善溶解性 羧甲基化羧甲基化 硫酸化硫酸化 磷酸化磷酸化 羧甲基化羧甲基化 1 1 多糖多糖 0 15M NaOH 95 0 15M NaOH 95 o o C 2h C 2h 残残 渣水洗至中性渣水洗至中性 悬浮于悬浮于0 06 NaCl 0 06 NaCl 醋酸调醋酸调pHpH至至 4 5 504 5 50 o o C 6h C 6h 悬浮液悬浮液pHpH调至碱性调至碱性 氯乙酸反应氯乙酸反应 羧甲基化多糖钠盐羧甲基化多糖钠盐 2 2 多糖均匀分散异丙醇中多糖均匀分散异丙醇中 加粉状加粉状NaOH NaOH 搅拌搅拌 氯乙
9、酸进行非均相反应氯乙酸进行非均相反应 产物产物 硫酸化硫酸化 在质子惰性溶液在质子惰性溶液 DMSO DMF DMSO DMF 中进行中进行 加入一定比例氯磺酸吡啶盐加入一定比例氯磺酸吡啶盐 控制温度及时间控制温度及时间 获得不同取代度的硫酸酯化多糖获得不同取代度的硫酸酯化多糖 可以上述两种方法结合可以上述两种方法结合 如如 分枝的分枝的 1 1 3 Glucan3 Glucan 先去侧链先去侧链 再羧甲基化再羧甲基化 获得线状羧甲基葡获得线状羧甲基葡 聚糖聚糖 显著免疫及抗肿瘤活性显著免疫及抗肿瘤活性 美国专利报导美国专利报导 己应用于灵芝己应用于灵芝 灰树花灰树花 巨大口蘑巨大口蘑 水溶性
10、好水溶性好 抗癌活性高的衍生物抗癌活性高的衍生物 目前研究得较为深入 高等真菌 主要是蘑菇类 产生的 葡聚糖 某些植物产生的具抗补体作用的 果胶类多糖 影响构效关系研究 1 多糖的化学平面结构测定比较困难 特 别是含有几种糖残基的杂多糖 至于决定多 糖活性的高级结构 三维结构 测定更难 因为 多糖是水溶性胶状物质不能结晶 这样限制了 用通常X 衍射方法去测定立体结构 2 多糖的体内药物代谢动力学研究困难 3 多糖在分子水平下与蛋白质 核酸等其 他分子相互作用的认识还不清楚 由于目 前有关多糖的药理研究主要局限于观察多 糖在体外或体内的生物效应 要达到分子 水平 细胞水平还需大量研究 己有的实验
11、证明影响多糖生物活性的主要 因素 分子量 分枝度 高级结构 溶解度 粘度等 多糖 大分子 分子内的糖苷键有较强的 旋转性 决定了多糖的二级结构 氢键 范德华力 色散力和疏水性等非共 价作用 决定了多糖的三级结构 蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖 分子量 10万至100万 分枝度为2 3至1 5 三股螺旋立体结构的 葡聚糖 香菇多糖 云芝糖肽 裂褶菌多糖 正式在临床上应用 证明在提高机体免疫功能上特别是 肿瘤辅助治疗中具有显著作用 受到 临床医生的青睐 但是 人们期待更有效的活性多糖 的问世 特别是具有抗炎作用 抗病毒作用 降 血糖作用 刺激神经细胞作用的多糖问世 目前主要可从二方面着手 一是继续从
12、高等真菌 如灵芝 猪苓 猴 头菇 冬虫夏草 姬松茸 中寻找活性多糖 同时重点从动植物特别是从传统的中 草药及海洋生物 如海藻 中寻找高效的 活性多糖 实验证明 许多属去邪扶正的中药 发挥主要作用的大多是多糖成份 从中草药及海洋生物中寻找有效的 活性多糖 方向 最新报道 藻类中主要存在的硫酸酯多糖 可以抑制HIV I表面糖蛋白gp120与免疫 细胞表面CD4 受体的结合 抑制合胞体的形成 特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止Aids 通过性交途径的感染 具有成本较低 水溶性好 不产生机体不良 我们认为影响发现活性多糖的关键 分离纯化方法及检测手段 多糖是水溶性大 分子物质 它的分离纯化方法不同于一
13、般小分子物 质 而且常用的检测手段又不灵敏 所以常会将微量 高活性成份的多糖作为杂质而丢弃 结构改造及结构修饰 结构改造或结构修饰可以提高或改变多 糖的活性 如 具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作 用的香菇多糖 如分子中引入 硫酸基 后 则几乎不再具抗肿瘤作用 却具显著抗爱 滋病毒作用 同样结构修饰或改造也可以改变给 药途径 如高等真菌产生的具提高兔疫功 能的 葡聚糖 一般注射有效 口服无效 但如果连接有少量 肽 成为多糖肽 或连 接一些其他糖残基成为杂多糖 则口服有 效 这是制作真菌来源的保健品中值得注意的 问题 却被许多人疏忽 譬如说市场上已有的香 菇多糖保健品 实质上香菇多糖 Lentina
14、n 口 服是无效的 那么为什么这些保健品确实还是 对人体有良好作用呢 这是因为香菇提取物中 不仅存在香菇多糖 还存在其他对人体有效的 活性物质 而真正起作用的就是这些活性物质 可以这么说保健品中香菇多糖含量越高 其效 果越差 所以如果将香菇提取物命名为香菇多 糖保健品是不恰当的 目前对于多糖进行结构改造或修饰常用的方法 过碘酸盐氧化 Smith降解 部分水解 衍生化 硫酸化 羧甲基化 羧乙基化 磷酸化 棕榈酰化 多糖的羧甲基化可以提高多糖的水溶 性 一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高 多糖中引入硫酸基一般均可显著提高 其抗爱滋病毒的活性 且其活性随主链中的 氨基糖及分枝度的增加而增加 但随主链中
15、 去氧已糖及分枝度的增加而减少 从高等真菌中获得的 葡聚糖大多具明 显的免疫活性 但它们在消化道内难以被肠道 壁直接吸收而进入血液 所以必须通过注射才 能发挥作用 如果进行结构修饰 使其能被消 化道吸收 变注射为口服 则将大大简化给药 途径 从植物及海藻中获得的活性多糖一般是 杂多糖 它们大多口服也有效 植物及海藻来源的活性多糖可以 作为保健品的优越之处 多糖是亲水性大分子 难以透过由脂质 构成的细胞膜 所以口服有效常受到质疑 有 人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应受体 分子起作用 或者通过胞饮内吞作用 pinocytosis 由消化道进入血液 然后刺激 人体免疫细胞的成熟 分化和繁殖 诱导专
16、一 性细胞因子的产生与激活 所谓多糖是多细 胞因子诱导剂 结果由这些免疫细胞去吞噬 或杀死肿瘤细胞或阻断细菌 病毒的吸附或 繁殖 有人认为 葡聚糖是一种融合诱 导剂 它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的 融合 从而使肿瘤细胞消失 上述这些 作用机制的理论有的虽被初步实验证 实 有的却是推测 有待人们去进一步 完善 由此可见 至今活性多糖的研究尚 属初级阶段 多糖的应用可分为两个方面 一类是利用多糖的独特理化性质 如易形成凝胶 高渗透压 高粘度和吸 水性 制备医药材料 药物缓释剂 血 浆代用品等 另一类利用多糖的抗原性 抗肿瘤 降血糖 促进免疫功能等生物功能或 活性制备疫苗或新药 至今从多糖中寻 找具有抗爱滋病的新药已引起人们很大 的兴趣 美国学者M Yalpani认为 至今多糖在生物技术领域仍是一个 沉睡的巨人 有待于大家去唤醒 可以预言 活性多糖的研究与开发将成为生命 科学中的重要课题 多糖 多糖是由十个以上单单糖通过过糖苷键键以共价键键形式 结结合起来的聚糖 Polysaccharide或glycan 可用 C6H10O5 n表示 其中n 10 自然界很少存在n为为10 30的多糖 匀多糖
