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1、病理学在疫病诊断中的 应用和石蜡切片制作技术,2011.08.22,第一部分,病理学在疫病诊断中的应用,一、动物疫病的复杂形势,（一）动物疫病种类多 （二）新发动物疫病不断出现 （三）病原型别多、变异快 （四）2010年列入国家监测计划的动物疫病 （16种）,（一）动物疫病种类多,农业部一、二、三类动物疫病病种目录中列入157种：其中一类动物疫病17种，二类动物疫病77种；三类63种 。 OIE陆生动物卫生法典2010版中列入94种：其中多种动物共患病26种，牛病14种，绵羊和山羊病11种，马病11种，猪病8种，禽病14种，兔病2种，蜂病6种，其他疫病2种。,（二）新发动物疫病,非洲猪瘟（俄罗
2、斯等国，我国最近发生的小猪流行性腹泻又是怎么回事？） 小反刍兽疫（西藏） 口蹄疫（新发亚型的出现）,（三）病原型别多、变异快,口蹄疫：7个型 多个亚型 流 感：A B C 3个型。亚型：HA有16种亚 型，H116 ，NA有9种亚型，N19 。 蓝耳病： 1996年美洲型 2006年变异株 2009年欧洲型,（四）2010年列入国家监测计划的动物疫病,高致病性禽流感、新城疫、口蹄疫、高致病性猪蓝耳病、猪瘟、布鲁氏病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病 外来动物疫病：牛海绵状脑病（疯牛病）、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、痒病、非洲猪瘟、蓝舌病。 注：结核病、狂犬病、牛海绵状脑病均可通过病理学的方法
3、确诊，而且目前牛海绵状脑病只能通过病理学的方法确诊,二、目前实验室常用的检测技术,血清学检测技术 分子生物学检测技术 病原学检测技术 病理学检测技术,三、病理学及检测技术,1、病理学在医学及兽医学中的地位 病理学是基础医学与临床医学之间的桥梁 动物学. 解剖学 预防兽医学(寄.传) 组织胚胎学.生理学 临床兽医学(内.外.产) 生物化学微生物学 公共卫生学 病理知识和病理诊断是临床疫病诊断治疗的依据。,病理学,在临床医疗中，病理诊断是诊断疾病的最可靠的方法，有“金标准”之称（确诊）。 病理医生在国外被称为“医生中的医生”。 一个医院的水平取决于诊断水平，而诊断水平取决于病理诊断水平（动物医学病
4、理要向人医病理学习）。,2、病理检测技术,（1）常规病理学检测技术 利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变化对动物疫病进行诊断。 狂犬病、结核、牛海绵状脑病、肿瘤（马立克、白血病、禽网状内皮增生症以及其他的常见肿瘤。）发现新疫病。,肿瘤,鸡淋巴白血病,网状内皮增生,淋巴结核,脂肪肝,（2）免疫病理学检测技术 -免疫组织化学技术,基本原理 免疫组化染色是引入附有标记物的外源性抗体（或抗原），使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原（或抗体）部位，标记物经呈色反应而显示待检抗原（或抗体）。,亲和素（卵白素）是从卵清分离的一种糖蛋白。1个分子内有4个与生物素结合的位点。,屠宰猪肝脏HEV免疫组化
5、染色，被膜下散在肝细胞核和少量细胞浆呈阳性反应细胞（免疫组化染色，40）； The expression of HEVAg in nuclear of some liver cell of slaughtered swine (Immunohistochemical staining. 40)；,屠宰猪肝脏中散在HEV免疫组化强阳性反应细胞（免疫组化染色，40）； The expression of HEVAg in liver cell of slaughtered swine.（Immunohistochemical staining.40）,（3）原位杂交,荧光原位杂交,（4）超微病理学
6、（电镜细胞化学）,电镜细胞化学是在光镜组织化学基础上发展起来的一门生物技术.(作为一门学科)它是在超微 水平上观察细胞内化学物质,并在此基础上 进一步阐明其生理和病理状态下的生化代 谢改变。,在光学显微镜下所见的结构,称为显微结构.。现一般光学显微镜最大分辨率约为0.2m,最大放大倍数为14001500倍。细胞内的结构如线粒体、中心体、核仁、高尔基体、染色体等都大于0.2m。因此能在光学显微镜下观察到。,在电子显微镜下所显示的结构一般称为超微结构(US)。目前常用于超微结构研究的工具有电子显微镜、X光衍射仪等。电子显微镜分辨率一般可达0.12nm。最高的分辨率已经接近了对单个原子(一个埃A左右
7、)的分辨.(放大倍数高达80100万倍).,狂犬病毒,第二部分,石蜡切片制作技术,一、目的意义 活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出， 组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。,光学显微镜的制片技术方法可分为两大类： 非切片法 切片法,非切片法：是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离，如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法
8、配合使用，各取其长处。,切片法：是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。,光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制
9、作切片，才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。,取 材,固 定,脱 水,透 明,包 埋,切 片,染 色,封 片,二、石蜡切片制作步骤, 取材,材料的好坏直接影响到切片的质量。,注意事项,当怀疑病畜死于传染病、侵袭病或中毒病的时候，应由县(市、区)动物疫病预防控制中心进行诊断，做不出结果时，迅速采取病理材料送交省、地、市动物疫病预防控制中心检验室、农业大学动物病理诊断实验室或其他检验机
10、构进行检查。 病理组织学检验材料需及时采取,及时固定,以免自溶出现死后变化,影响诊断。,用作病理组织学检验的组织病料应选取病变最典型、最明显的部位，并应包括病灶和其邻近的正常组织两部分。这样便于对照观察,更主要的是看病灶周围的炎症反应变化。 采取的病理组织材料,要包括各器官的主要结构, 如肾应包括皮质、髓质、肾乳头及被膜。,选取病料时,切勿挤压（可使组织变形）、刮抹（使组织缺损）、冲洗(水洗易使红细胞和其他细胞成分吸水而胀大, 甚至破裂)。 选取的组织不宜太大,长宽厚一般为1.51.50.5(厘米)。尸检取标本时可先切取稍大的组织块,待固定一段时间(数小时至过夜)后,再修整成适当大小,并换固定
11、液继续固定。常用的固定液是10%福尔马林,固定液量为组织体积的510倍。容器可以用大小适宜的广口瓶。细小组织（小于5mm、纤维镜活检标本）及脆而易碎的小组织，请先附贴于滤纸上再放入固定液中，以免遗漏。,记录与存放。取材完毕后应在固定容器表面贴好标签，表明标本名称和编号，有的瓶口可用蜡严密封闭。同时，应对被检组织进行核对，整理好的尸检记录及有关材料,并在送捡单中说明送检的目的和要求。标本来源：系指手术切除的部位或器官。如“结肠癌”、“子宫肌瘤”等等。应填写“结肠”、“子宫”，不要填写“术中”；送检标本容器上应贴有病畜的种类和标本部位，同一患畜同时取有数种组织，或同一组织由不同部位取出，应分盛容器
12、，分别注明，并在病理送检单上注明送检标本的份数及部位；标本瓶口宜大，便于标本的取出。病理检查申请单是医疗举证的重要文书，是病理诊断中心永久保存的医 学资料，请务必保持清洁、完整无损，请勿涂改。严禁用病理检查申请包裹标本容器送检。,病理报告：病理诊断报告在收到病理标本后五个工作日发出，须加做特殊染色和/或免疫组化染色者除外。, 固定,固定是将需保留或制作成标本的脏器或病变组织浸入固定液内，使组织的形态结构尽可能保持在生前的状态，组织细胞的物质成分变为不溶性，而得到保存，且能适于某些研究程序。,1、固定的意义与作用 在一般情况下,凡是需要制作成大体标本和显微镜切片标本的各种病理组织,都要先行固定。
13、固定是切片制作的关键。固定不良在以后任何阶段皆不能补救。 因此,可以说没有良好的固定基础,就不可能制作出质量可靠的组织学切片,反映不出被研究的组织细胞的生化特点,以致影响诊断结果。,杀死细胞, 改变组织细胞膜的通透性, 使染料 或作用物能进入细胞内。 抑制自溶和腐败。 固定使细胞内蛋白质、脂肪、糖等各种成分沉 淀凝固,从而保持其原有的结构和性质。 固定也可使细胞从正常溶胶状态凝胶状态，从而增加组织的硬度，有利于制片。,2、固定时应注意的事项 取材新鲜,固定及时。 处死方法:一般是采用 兔耳静脉注入空气, 造成急性心血管的空气栓塞, 循环障碍； 鼠是剪断颈部放血； 鸭采取拉颈椎使之脱位损伤延髓；
14、 鸡常采用切断颈静脉放血或扭拉延髓致死。 采取的组织应立即放入固定液中使其固定，以免发生自溶、失水。,切取的组织块不宜过大,大小厚薄应较一致。 大小一般为1 1. 5cm; 厚小于5mm; 切取组织用的刀剪要锋利,切忌来回拉锯式切割,以免造成挤压、碎裂。用镊子夹时不要用力过大,鼠齿镊子损伤的部位不能用。 所取组织不应用刀刮、涂擦;更不应用水冲洗、浸泡。,所取组织应包括病变部位和邻近的健康的部位,这样有利于对照鉴别。 另外,所取组织应包括器官的基本或重要结构。如肾脏应包括皮质、髓质、包膜和肾盂、肾乳头;胃肠道应包括粘膜至浆膜各层结构。,固定液要充分，一般为组织块体积的10倍。 固定所用的容器应宽
15、大,以使组织块在固定过程中不被挤压变形并得到充分固定。瓶口不能过小,以免固定的组织变硬取不出来。同时注意组织块与容器不要贴壁。 对于柔软或薄的组织,为了防止固定后的扭 曲.变形，可在切取时将其平摊在吸水纸上，再固定。肺组织常漂浮，不宜固定，最好用注射器抽吸肺内气体，以利固定液侵入。,所取的组织块较多时,为避免混淆,应加标记。容器上应贴标签，注明固定液、采集日期、编号等。 一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合；固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。 固定液的选择要适当,3
16、、固定的方法： 最常用的是浸泡固定， 特殊情况下采用灌注固定 和蒸气固定。,4、固定液的选择与应用 用于固定组织标本的试剂很多。由各种固定剂配制的固定液已多达上百种。 不同固定液有不同的作用。因而,在应用固定液时应根据组织标本的性质、观察或研究的不同目的恰当地选择所需的固定液。,在选择与应用固定液时应注意下述问题： 固定液的性质与作用 各种固定剂，其化学性质及固定作用不同。有的为氧化剂,有的为还原剂；有的能够凝固或沉淀蛋白,固定脂肪或糖元；有的则能溶解或破坏脂肪及糖元；有的能引起组织收缩，有的则引起组织膨胀；对组织的渗透压力及硬化程度的大小等也不相同；有的不仅能够保存组织标本的形态结构及某些物质成分,而且还有媒染作用，有的则无明显的媒染作用,甚至妨碍某些染料的着
