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1、EBV LMP2 B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究,温州医学院2004级硕士学位论文答辩,答辩人：欧 琴 导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授 专 业：病原生物学 2007.5.17,主 要 内 容, 研究背景 研究目的 研究方案 结 果 分析与讨论 结 论,研 究 背 景,EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)属于疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。,研 究 背 景,肿瘤 亚型 EBV阳性率,表1 EBV相关的增生性疾病,Burkitt淋巴瘤 E-B
2、L 100% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% NPC 低分化或未分化 100 霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30 T细胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40% 淋巴母细胞瘤 fatal IM 100% 与器官移植相关 100 与AIDS相关 70-80%,研 究 背 景,LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。,研 究 背 景,表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。,研 究 背 景,NPC患者血清中能检测LMP2
3、抗体。 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提 供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。,研 究 目 的,1. 预测EBV LMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2. 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。 3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在N
4、PC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。,研 究 方 案,一、EBV LMP2的二级结构分析 和B细胞表位预测,研 究 方 案,采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索 LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (http:/www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 预测LMP2二级结构(http:/www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 (http:/www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的H
5、opp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、 Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及 柔韧性参数(http:/www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) ； 对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并 用吴玉章等建立的抗原性指数(AI) 综合评判EBV LMP2的B细胞优势 表位。,研 究 方 案,二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、 表达及其融合蛋白的纯化,研 究 方 案,引物设计与合成,退火获得目的基因,pET32a (+)/EBV-LMP2 B细胞表位重组质粒的构建,纯化、连接、转化DH5
6、大肠杆菌,转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白,SDS-PAGE、Western blot分析,pET32a (+)质粒酶切,酶切、测序鉴定,研 究 方 案,引物 碱基序列 酶切位点,OZLF-67 5TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAA BamHI AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3 OZLF-68 5GATCCCGCATCGAAGATCCGCC XhoI CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3 OZLF-69 5TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3 BamHI OZLF-70 5GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3 Xh
7、oI OZLF-71 5TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC BamHI TGTGCTGGACAATGATTTG 3 OZLF-72 5GATCCAAATCATTGTCCAGCACA XhoI GAATTTATCCCGAATTAAC 3,图1 pET32a/B细胞表位的重组质粒图,研 究 方 案,研 究 方 案,层析纯化蛋白：,灌 胶,Buffer B液调节吸光度和透光度,样本处理,样本加入层析柱中，收集滤液,Buffer B液洗涤，至A0.01，收集滤液,Buffer D液洗涤，至A0.01，收集滤液,Buffer E液洗涤，至A0.01，收集滤液,样本收集,SDS-PAGE分析滤
8、液中目的蛋白分布情况,Buffer B: 8M尿素(pH8.0) Buffer D: 8M尿素(pH6.8) Buffer E: 8M尿素(pH4.0),研 究 方 案,三、EBV LMP2 B细胞表位融合蛋白 免疫原性的初步研究及血清学检测,研 究 方 案,动物：ICR小鼠 免疫方式：背部皮下多点注射 采血方式：眶静脉采血，3只/组,研 究 方 案,ELISA检测：,以纯化的融合蛋白作包被抗原 以B95.8细胞作包被抗原 选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体,结 果,一、EBV LMP2的二级结构 分析和B细胞表位预测,结 果,H:-螺旋
9、；e:-片层；c:无规卷曲；-:未预测结构；t:-转角 图2 EBV LMP2二级结构预测,结 果,aa 144150 202208 265268 318322 375390 445455,图2 按SOSUI程序预测EBV LMP2蛋白跨膜区,膜内区域,跨膜区,膜外区域,结 果,图3 各种不同参数对EBV LMP2的预测结果,a.亲水性参数 b.极性参数 c.柔韧性参数,d.表面可及性 e.抗原性,二级结构 1082,89108,116126,142149,198206,288295,317321, 339348,379389,414422,481497 膜外区域 144150,202208,
10、265268,318322,375390,445455 亲水性 1526,3641,4360,6574,9096,101119,176179,199205, 236242,414416,483492 表面可及性 1318,2022,2532,3964,6782,9092,95112,114116,73 178 199201,203204,235240,378380,383384,416 420,484 496 抗原性 1083,88109,111121,174179,198207,235241,290293,340 348,380387,413421,471476,483491 极性 2023
11、,4555,5759,6574,9094,102117,198203,234342,483491 柔韧性 1085,89121,199205,218222,236244,289296,342347,370 378,381383,385388,412420,483493,预测方法 预测结果,结 果,表3 应用不同方法预测EBV LMP2 蛋白B细胞表位的肽段位置,结 果,145150 TASVST 0.005 199209 RIEDPPFNSLL 0.037 318322 TLNLT 0.036 381391 KSLSSTEFIPN 0.028,B细胞表位区域 氨基酸序列 抗原性指数,表4 EB
12、V LMP2的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数,二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、 表达及其融合蛋白的纯化,结 果,结 果,图4 重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:p
13、ET32a(+)/EcoR I,图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71; 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,重组质粒酶切鉴定,结 果,测序结果,图7 3个重组的目的基因的测序图,结 果,B细胞表位融合蛋白鉴定,图8 B细胞表位融合蛋白表达产物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子标准物； 2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-6
14、9蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达； 6: BL21,结 果,ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化,图9 纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-7：Buffer E液滤液,图10 纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-8：Buffer E液滤液,图11 纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品
