第7讲作物氨基酸代谢生理

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1、作物氮代谢生理导论 刘正辉 liuzh 氨基酸（amino acid）除了在蛋白质合成中起着众所周知的作用外，在植物的 初级和次生代谢中也发挥了重要功能。 一些氨基酸作用于氮源的同化和源-库转运，另一些则是次生代谢产物（如激 素和植物防御相关物质）的前体。氨基酸合成直接或间接影响着植物生长发 育的各个方面。 本章将着重讲述一些例子，这些例子中，通过综合应用分子生物学、生物化 学和遗传学方法，确定了植物体内的代谢途径并揭示了氨基酸生物合成的调 节机制。 植物体内氨基酸的生物合成：研究现状与前景植物体内氨基酸的生物合成：研究现状与前景 无机氮同化进无机氮同化进N-转运氨基酸转运氨基酸 1. 氨基酸

2、的生物合成：研究现状与前景氨基酸的生物合成：研究现状与前景 1.1 植物中氨基酸合成途径主要由微生物的相关代谢途径推植物中氨基酸合成途径主要由微生物的相关代谢途径推 测而来测而来 植物氨基酸生物合成所需的碳骨架来源于糖酵解、光合作用中的碳还原反应、 氧化磷酸戊糖途径以及柠檬酸酸循环。 虽然研究人员已基于微生物体内氨基酸合成途径及机制的研究，提出了植物的 氨基酸合成途径的推测。但直到现在，我们还不能确定植物是否利用了细菌和 酵母的那些酶促途径和调控位点。 在植物中，氨基酸合成途径中的任何一个步骤都可能有多个基因与之相对应， 并且一些连读的步骤还可能会在特别的亚细胞区室中进行。 由于人们现在对氨基

3、酸及其中间产物在植物细胞内和细胞间的转运机制不甚了 解，所以无法仅仅通过体外生物化学的方法预测同工酶在植物体内的功能。 糖酵解、三羧酸糖酵解、三羧酸 循环和卡尔文循循环和卡尔文循 环的有机酸产物环的有机酸产物 为为20种标准氨基种标准氨基 酸的合成提供了酸的合成提供了 骨架。骨架。 未列出三种芳香 族氨基酸的底物 （4-磷酸赤藓糖） 及合成组氨酸的 底物（核糖-5-磷 酸） 植物氨基酸合成概述植物氨基酸合成概述 1.2 拟南芥突变体的研究揭示了植物部分氨基酸的合成及其拟南芥突变体的研究揭示了植物部分氨基酸的合成及其 调控机制调控机制 人们对于微生物氨基酸合成途径的认识大多源于对特定氨基酸营养缺

4、陷型 （auxotrophic）突变体生化特性的分析。以前，分离植物中响应的氨基酸合成突 变体收到几个因素的限制，包括基因冗余以及一些与营养缺i型互补相关的问题。 近年，人们通过集中不同的遗传筛选（genetic screen）方法鉴定了一些氨基酸生物 合成酶的植物突变体，包括色氨酸合成突变体的正选择（positive selection）、积 累代谢中间产物的突变体的筛选、光呼吸突变体的筛选、谷氨酸脱氢酶和天冬氨 酸氨基转移酶缺失突变体的筛选。人们已开始通过研究这些植物突变体的表型来 揭示那些与氨基酸生物合成相关的特定基因的体内功能，并确定其多步合成途径 中的关键步骤或者限速步骤。 另外，植

5、物中氨基酸生物合成基因调控的分子生物学研究表明，在某些情况下， 转录调控在整个途径的调控中起主要作用。例如，控制谷氨酰胺和天冬酰胺合成 的基因都不是组成型表达的“看家”基因，相反，它们在不同类型的细胞中差异 性表达，而且还收光及代谢的调节。现在，对于植物氨基酸生物合成突变体的研 究集中在一个双子叶的模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）上。 1.3 植物氨基酸代谢途径既有基础研究价值又有应用研究价植物氨基酸代谢途径既有基础研究价值又有应用研究价 值值 对植物特有的氨基酸合成途径的揭示必将刺激基础研究和应用研究的共同发 展。这些研究的一个目标就是要了解那些调节限速生长过程的基

6、因，以及那 些调节氨基酸前体合成植物次生代谢物的因子。 这些研究也为以后在转基因植物中控制氨基酸的合成途径提空了基本框架。 例如，人们已经把一些氨基酸合成途径中的酶定为除草剂的作用靶点。 另外，人们还把编码氨基酸合成相关酶的基因应用于抗除草剂的基因工程中。 最终，未来氨基酸合成研究的成果将提高农作物对渗透压的抗性，并改善食 物的蛋白质组成。 对于控制植物氨基酸合成的结构基因和调控基因的研究不仅是生物化学家的 兴趣所在，也引起了农业工作者的极大关注。 2 无机氮同化进无机氮同化进N-转运氨基酸转运氨基酸 植物通过同化作用把无机氮同化为一类N-转运氨基酸（N-transport amino aci

7、d）：谷氨酸谷氨酸、谷氨酰胺谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺天冬氨酸和天冬酰胺。 它们主要用于将氮从源器官向库组织的转移，同时在氮源充足条件下贮存氮， 以备植物生长、防御和繁殖所需。 同化成谷氨酸和谷氨酰胺的氮立即进入植物代谢，因为这些氨基酸为核酸、 其他氨基酸及含氮化合物的合成提供氮源。 另外，谷氨酸、谷氨酰胺中的氮也可以整合到天冬氨酸和天冬酰胺中。 天冬氨酸是一种具有代谢活性的氨基酸，为很多转氨酶参与的反应提供氮。 而天冬酰胺的活性相对较低，主要作为氮的转运和贮存化合物。 由由HPLC测定的光处理和暗处理后的拟南芥自由氨基酸的浓度测定的光处理和暗处理后的拟南芥自由氨基酸的浓度。Glu、Gln、

8、Asp、Asn占了 自由氨基酸的70%；Gln，具有代谢活性氨基酸主要在有光条件下合成；Asn，相对惰性的 氨基酸主要在黑暗中合成；Asn比Gln有更高的铵碳比，所以当碳骨架有限（黑暗中）时， 它便是一个更经济的转运氮的化合物；Gly是光呼吸的副产物。 谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺是大多数植物韧皮部转运的主要氨基 酸。这些氨基酸的浓度不是恒定的，而是受到了光等因素的调节的。 参与合成参与合成N-转运氨基酸的酶转运氨基酸的酶：谷氨 酰胺合成酶（GS）；谷氨酸合酶 （GOGAT）；天冬氨酸氨基转移酶 （AspAT）；天冬酰胺合成酶（AS） 这些酶不仅参与土壤中无机氮的初 级同化作用，也和植

9、物体内自由铵的 在此同化有关。 植物体内有机化合物通过多种途径 把铵释放出来，如光呼吸时，植物体 释放的铵是初级铵同化作用的10倍。 如果植物不能重新利用这些铵，很快 就会耗尽其氮储备。 植物中参与将铵同植物中参与将铵同 化进化进4种种N-转运氨基转运氨基 酸的酶之概述酸的酶之概述 2.1 GS/GOGAT循环是植物的主要氮同化途径循环是植物的主要氮同化途径 人们认为GS/GOGAT途 径是铵初级和次级同化 的主要途径。 重氮丝氨酸 甲硫氨酸亚矾铵（MSO) L-膦丝菌素（L-PPT) 谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶 共同参与GS/GOGAT循环； 在细胞质和叶绿体中发现的 GS同工酶分别是GS1

10、和GS2 （离子交换层析），它们是同 源基因的产物； 两类GOGAT同工酶： Fdx-GOGAT(光合生物） NAD(P)H-GOGAT（植物/ 细菌） 高等植物的质体中两者都有 2.2 分子及遗传的研究证明，胞质和叶绿体分子及遗传的研究证明，胞质和叶绿体GS同工酶在体内同工酶在体内 各自行使不同的功能各自行使不同的功能 离子交换层析分离GS2和胞质中GS1的试验结果表明：定位于质体中的GS2同工酶是叶 片中发挥主要功能的GS酶。 叶绿体GS2突变体表现出条件致死性，叶绿体的GS2酶与光呼吸作用所释放铵的再次同 化有关； GS2突变体的胞质GS1表达量保持正常，胞质GS同工酶是独立发挥作用的。

11、 转基因烟草植株的照片和光学纤维照片说明转基因烟草植株的照片和光学纤维照片说明，GS1和和GS2启动子在不同的组织中表达启动子在不同的组织中表达。 图中定位于叶绿体内的GS2的启动子在光合细胞中（AD)表达，然而胞质GS1的启动 子在韧皮部中表达。 CH:绿色组织；CL：厚角组织；E：表皮；LB：叶片；MV:中脉； PH:韧皮部；PP：栅栏薄壁组织；PT:髓部薄壁组织；R：根；SP：海绵薄壁组织；T： 表皮毛；V：维管系统；X：木质部 占野生型占野生型GOGAT活性的百分比活性的百分比 Fdx- GOGAT NADH- GOGAT 总总 GOGAT 野生型野生型 拟南芥拟南芥955100 大麦

12、大麦973100 Fdx-GOGAT突变体突变体 拟南芥拟南芥gluS 等位基因等位基因 5510 大麦大麦Rpr82/9135 2.3 突变体研究表明突变体研究表明Fdx-GOGAT在光呼吸中起主要的作用在光呼吸中起主要的作用 对植物中的Fdx-GOGAT和NADH- GOGAT进行了广泛的生化鉴定。 但是目前仍然不清楚这些同工酶 的体内功能是相互重叠还是彼此 不同。 把不同组织中各个同工酶的定量 分析结构作为间接证据，来推测 他们的体内功能。 Fdx-GOGAT主要参与叶片的初级 氮同化和光呼吸。 NADH-GOGAT主要参与根部的 初级同化作用。 NADH依赖性和Fdx依赖性的GOGAT

13、同工酶（分别为Fdx-GOGAT和 NADH-GOGAT）在植物代谢中有着不同的生理作用。 Fdx-GOGAT在对光呼吸所释放铵的 二次同化过程中起重要作用，所有 的Fdx-GOGAT缺陷型突变体都是条 件致死型。 在促进光呼吸作用的空气条件下， 它们都会萎黄；但一旦光呼吸受到 抑制，又可以恢复正常生长。 Fdx-GOGAT缺失突变体仍能进行初 级氮同化。 叶片中低浓度的NADH-GOGAT对叶 片进行初级同化足够。 所有的gluS突变体都可能发生“泄 漏”，产生足够的Fdx-GOGAT来进 行初级同化。两个GLU基因。 2.4 虽然虽然GDH的基本功能是参与分解代谢，但是有证据表明的基本功能

14、是参与分解代谢，但是有证据表明 在存在大量铵时它也参与氮的同化作用在存在大量铵时它也参与氮的同化作用 GDH即能催化谷氨酸的合成和分解代谢。 GDH的正反应是催化-酮戊二酸的氨基化，逆反应则是催化谷氨酸的脱氨基， 产生-酮戊二酸和铵离子。 植物体有两类GDH酶：一种是在线粒体中依赖NADH的GDH,另一种是叶绿体 中依赖NAD(P)H的GDH。 在光呼吸中GDH只发挥很小作用。 生化证据：生化证据： GDH对铵有较高的Km值（1080mmol/L）,而组织中铵的浓度通常在 0.21.0mmol/L之间。 15NH4+标记植物的实验表明谷氨酸合谷氨酰胺是前体与产物的关系，与 GS/GOGAT参与

15、氮初级同化作用一致。 用GS抑制剂MSO处理植物，虽然处理过的植物GDH有较高活性，而且 铵离子有较高浓度，但铵不能被整合进谷氨酸合谷氨酰胺。 虽然对光呼吸突变体进行筛选可以得到GS2和Fdx-GOGAT缺失突变体， 但得不到任何GDH突变体。 GDH在体内的主要功能是参与谷氨酸的分解代谢：在碳源并不充裕（黑 暗）的条件下，GDH的活性受诱导激活，可能催化谷氨酸的脱氨基反应， 为三羧酸循环提供碳骨架。 在高铵浓度下植物中的GDH的活性受诱导增加。 分子证据：分子证据： 对GDH基因所编码的蛋白质序列进行分析，发现每一个GDH基因都编码 了一个可能有线粒体靶向序列的依赖于NADH的酶。 编码GD

16、H的mRNA在黑暗中或碳源有限的条件下会增加。 2.5 GDH突变体为研究突变体为研究C3和和C4植物中植物中GDH同工酶的功能带来同工酶的功能带来 希望希望 人们已经鉴定出缺失了特定GDH同工 酶的C4植物突变体（玉米）和C3植物 突变体（拟南芥）。 7种同工酶是两类GDH亚基（GDH1和 GDH2)结合形成的六聚体，其中两个是 同源六聚体，其它5个是由GDH1和 GDH2单体结合而成的异源六聚体。 在拟南芥中有两个GDH基因，其中 一个基因的作图位置与突变基因(gdh 1- 1)一致，这个突变基因能够导致含 GDH1亚基的同源或异源GDH全酶特异 性缺失。 无论玉米还是拟南芥的gdh1突变体都 没有完全丧失GDH活性，因为它们都有 正常量的GDH2同源六聚体。 与野生型拟南芥相比，gdh-1突变体在高无机氮浓度条件下生长受阻。GDH1在无 机氮过量时能对铵进行同化。 拟南芥gdh1突变