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1、毛细管电泳分离原理及分析策略毛细管电泳分离原理及分析策略 CECE分离原理分离原理- -与模式有关与模式有关 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE） 毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKCMECC/MCKC） 毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGECGE） 毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（cIEFcIEF） 亲和毛细管电泳（亲和毛细管电泳（ACEACE） 毛细管电色谱（毛细管电色谱（CECCEC） 第一章第一章 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 样品在电解 液中泳动,根 据物质的荷/ 质比差异来 进行分离， 比值愈大,跑 得愈快 进样方式进样方式 n压力进样 n电动进样
2、 n浓缩进样 毛细管种类毛细管种类 非涂层毛细管（裸管）非涂层毛细管（裸管） 内壁涂层毛细管（涂层管）内壁涂层毛细管（涂层管） 非涂层毛细管非涂层毛细管- -电渗流的概念电渗流的概念 - H+ 高pH低pH 电渗流的特点电渗流的特点 EOFEOF -+ 纯电泳状态纯电泳状态 -+ EOF 电泳电泳+电渗流电渗流 0 tm (min) 电渗流的作用电渗流的作用 电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点 Hydrodynamic flowHydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader de
3、tection zone EOF gives plug flowEOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone Hydrodynamic flowHydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone EOF gives plug flowEOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zon
4、e 电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点 电渗流是电渗流是CECE中最大的驱动力来源之一中最大的驱动力来源之一 电渗流的正面及负面作用电渗流的正面及负面作用 正面作用正面作用 增加分离速度增加分离速度 使得正、负电荷物质同使得正、负电荷物质同 时分离时分离 负面作用负面作用 减少分离时间和分离有减少分离时间和分离有 效距离效距离 电渗流的波动极大的影电渗流的波动极大的影 响了迁移时间的重复性响了迁移时间的重复性 影响电渗流的因素影响电渗流的因素 pHpH值值 pHpH越高，电渗流越大越高，电渗流越大 离子强度离子强度 离子强度越高，电渗流越小离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂缓冲溶液添加
5、剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精 电渗流随电渗流随pHpH的变化情况的变化情况 控制电渗流的三个重要手段控制电渗流的三个重要手段 1.1. 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 2.2. 改变改变pHpH，从而调整电渗流的大小。，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流基本不增以后，电渗流基本不增 加加 3.3. 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小， 从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以 彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴彻底改变电渗流的方向
6、和大小，主要是在阴 离子分析时使用离子分析时使用 缓冲溶液的影响和选择缓冲溶液的影响和选择 在在CECE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 1.1. 在所选的在所选的pHpH范围内有较强缓冲能力；范围内有较强缓冲能力； 2.2. 在检测波长处有低的紫外吸收；在检测波长处有低的紫外吸收； 3.3. 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的 电流。电流。 那些被称为生物那些被称为生物“ “优良缓冲液优良缓冲液” ”的，如的，如Tris, borate, CAPSTris, borate, CAPS 等特别有用，因
7、为这些缓冲溶液中的离子一般较大，等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大， 能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个 潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。 常用的常用的CECE缓冲体系缓冲体系 磷酸钠体系磷酸钠体系 宽缓冲范围宽缓冲范围 硼酸钠体系硼酸钠体系 高高pHpH范围范围 Tris-HClTris-HCl体系体系 低低pHpH范围范围 醋酸醋酸- -醋酸铵体系醋酸铵体系 CE/MSCE/MS常用体系常用体系 CZECZE分离条件的选择分离条件的选择 毛细管类型毛细管类型- -涂层
8、还是非涂层？涂层还是非涂层？ 毛细管长度毛细管长度- -长毛细管还是短毛细管？长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系缓冲液体系- -种类和种类和pHpH值值 添加剂类型添加剂类型- -甲醇甲醇| |环糊精环糊精| |乙腈乙腈 检测器选择检测器选择- -紫外紫外| |二极管阵列二极管阵列| |激光诱导荧光激光诱导荧光 缓冲溶液的选择缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（ 最佳）最佳）pHpH范围后，再进一步细选出更好范围后，再进一步细选出更好pHpH和和 缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓 冲体系
9、之一，它的紫外吸收低，冲体系之一，它的紫外吸收低，pHpH缓冲范围比缓冲范围比 较宽（较宽（pH=1.5pH=1.51313），但电导也比较大。），但电导也比较大。 缓冲溶液及缓冲溶液及pHpH值的选择值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两 性样品，采用酸性（性样品，采用酸性（pH 2pH 2）或碱性（）或碱性（pHpH9 9） 分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类 样品通常在样品通常在pH=9pH=91111之间能获得最佳分离；之间能获得最佳分离； 羧酸或其他样品多在羧酸或其他样品多在pH=5pH
10、=59 9之间选择分离条之间选择分离条 件件。 缓冲溶液及缓冲溶液及pHpH值的选择值的选择 pH pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多的选择也和所用的毛细管种类有关，许多 涂层毛细管只能在一定的涂层毛细管只能在一定的pHpH范围内工作，例如范围内工作，例如 聚丙烯酰胺涂层毛细管，在聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3 3pHpH8 8的范围以的范围以 外工作，其涂层容易水解失效。外工作，其涂层容易水解失效。 缓冲溶液及缓冲溶液及pHpH值的选择值的选择 在相同的在相同的 pHpH下，不同缓冲体系的分离效果不下，不同缓冲体系的分离效果不 尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，尽相同，有的可能相差
11、甚远。一般的经验是， 能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最 好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和 DNADNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为 硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的 负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他 含邻位羟基或多羟基化合物的分离。含邻位羟基或多羟基化合物的分离。 缓冲溶液及缓冲溶液及pHpH值的选择值的选择 缓冲试剂及缓冲试剂及pHpH调节剂的浓度也需要优化。
12、缓调节剂的浓度也需要优化。缓 冲试剂的浓度一般控制在冲试剂的浓度一般控制在1010200 mmol/L200 mmol/L之间之间 。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其 浓度多控制在浓度多控制在20 mmol/L20 mmol/L附近，而电导小的试附近，而电导小的试 剂如硼酸及剂如硼酸及HEPESHEPES等，其浓度可在等，其浓度可在100 mmol/L100 mmol/L 以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的， 可采用很高（可采用很高（0.5mol/L0.5mol/L）的试剂浓度，此时）的试剂浓度，此时 要
13、注意减少分离电压，分析速度自然也将随之要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之 降低。降低。 添加剂的选择添加剂的选择 目的：目的： 1.1. 改善分离改善分离 2.2. 抑制分析物在毛细管上的吸附抑制分析物在毛细管上的吸附 添加剂的选择添加剂的选择 1.1. 甲醇甲醇| |乙腈（乙腈（5-50%5-50%） 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性增加非极性物质的水溶性 2.2. 环糊精环糊精|SDS|SDS等表面活性剂等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距
14、离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 3.3. 非极性高分子聚合物非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性形成一定的分子筛，提高分子大小选择性 第二章第二章 毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱 电解质电解质中加入中加入表表面活性面活性剂剂( (surfactantsurfactant，例如例如 SDS)SDS)，使使之之形成形成胶束（胶束（MicelleMicelle），样样品根品根据其据其 疏水性疏水性( (Hydrophobicity)Hydrophobi
15、city)强弱的强弱的差差异，异，在在胶束与胶束与 电解质的电解质的分配系分配系数数有所不同來有所不同來进进行分行分离离 ，样品，样品 疏水性愈強疏水性愈強，则进，则进入入胶束胶束的的机会机会愈大愈大。通常通常物物 质进质进入入胶束后，胶束后，泳泳动动的速度的速度会变会变慢慢，因此疏水因此疏水 性愈強的物性愈強的物质则质则愈慢出來。愈慢出來。 毛细管胶束电动色谱原理毛细管胶束电动色谱原理 SDS -+ EOF Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC) 七种青霉素的分离七种青霉素的分离 (A) CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点胶束电动色谱的特点 优点优点 增加对弱极性物质分离增加对弱极性物质分离 的分离度的分离度 在中药分析、天然产物在中药分析、天然产物 分析、农药分析中经常分析、农药分析中经常 使用使用 缺点缺点 稳定性不
