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1、UU任一目的基因原核表达载体构建 及表达鉴定 设计性、创新性实验 综合实验室 1 内容提示 1.实验基本原理 2.试剂及仪器准备 3.操作步骤 4.注意事项 5.实验意义 2 一、实验原理 DNA克隆又称基因克隆或分子克隆。广义的分 子克隆主要包括上游技术（重组DNA技术）和下游技 术（基因表达技术）。而狭义的分子克隆仅指重组 DNA技术。 3 基因重组基因重组：利用酶学方法将利用酶学方法将不同来源的不同来源的DNADNA分子分子 组装成一个新的重组组装成一个新的重组DNADNA分子。分子。 重组重组DNADNA 质粒质粒DNADNA基因片段基因片段 4 总体技术路线总体技术路线 分（离目的基
2、因）分（离目的基因） 切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞）转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）表（达目的基因） 5 目的基因目的基因基因载体基因载体 重组体重组体 分分 切切 接接 转转 筛筛 表表 总总 体体 技技 术术 路路 线线 6 7 解脲脲原体( Ureaplasma urealyticum, UU)亦称溶脲脲原 体，是六种脲原体属中的一种，与人类泌尿生殖道感染有 密切关系。在分类上属支原体科脲原体属。解脲脲原体是 人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，在特定环境下可致病 。近年来，解脲
3、脲原体所致泌尿生殖道感染日益受到重视 ，是引起非淋菌性尿道炎的病原体之一。现已被列为性传 播疾病的病原体。目前，尚无可行的疫苗供人类使用。本 研究为筛选潜在的UU疫苗候选基因奠定基础。 二、试剂及仪器准备 1引物设计与PCR扩增试剂，注意选用高保真酶 2酶切载体和目的基因试剂 限制性核酸内切酶BamH 和Not ，购至试剂公司，试剂公司附送相应的10限 制性核酸内切酶缓冲液 3载体和目的基因片段回收、纯化试剂 DNA片段胶回 收试剂盒，购至试剂公司，其组成为：吸附柱、收集管 、结合缓冲液（Binding Buffer）、洗脱液（Wash Solution）、EB缓冲液（Elution Buff
4、er）。 8 3连接反应试剂 T4 DNA连接酶，试剂公司附送相应的 10T4 DNA连接酶buffer。 4大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化。 5重组质粒的筛选试剂 （1）Amp母液：取氨苄青霉素钠溶于去离子水中，配成 25mg/mL溶液。过滤灭菌，分装储存在-20。 （2） LB液体培养基。 （3）含Amp的LB固体培养基 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g ，NaCl 5g，琼脂15g，加去离子水800ml，搅拌使其完全溶解， 用5mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为 1000ml，高压灭菌20min，冷却至60左右，加入Amp母液，使 终浓度为50
5、g/ml，摇匀后铺板，4保存。 9 6异丙基硫代-半乳糖苷（IPTG） 将1g IPTG 溶于4ml去 离子蒸馏水中，定容至5ml，浓度为200 mg/ml用0.22m过滤器除 菌，分装成1ml小份，-20保存备用，可保持4个月。 7琼脂糖凝胶电泳试剂 8蛋白电泳试剂 9DNA marker DL 2000；DNA marker DL 15 000。 10标准蛋白Marker 11菌落PCR相关试剂 dNTP(2.5 mol/L)、TaqDNA聚合 酶5U/l，10PCR buffer（含MgCI2，浓度为25mmol/L ）、dNTP混合物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2.5m
6、mol/L），均购至试剂公司。 10 12通用引物 引物序列为：PGEX5 5- GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3； PGEX3 5 -TATGGCTGATTATGATCAGT-3。 由引物合成公司 合成，并根据合成的引物浓度，用灭菌双蒸水将引物 稀释至5mol/L的浓度。 13Glutathione Sepharose TM 4B微珠，购至试剂公 司。 11 三、操作步骤 12 酶切目的基因与载体 连接为重组DNA分子 转化入感受态细菌 抗药性平板初筛 筛选 菌落PCR复筛 确定为阳性克隆 交叉PCR进一步鉴定诱导蛋白表达并SDS-PAGE鉴定 序列分析进行确定 在质粒载体
7、 上进行目的 基因克隆表 达的基本步 骤是： 1.目的基因扩增 根据NCBI提供的UU8型株基因组信息，筛选感兴趣的目的基 因，并应用primer5- 检查是否含有BamH 和Not 酶切位点 ？是-去掉 示例 应用PCR技术获得目的基因。琼脂糖凝胶电泳确定扩增效 果。满足要求后使用DNA纯化试剂盒回收目的基因，待用。 13 UU8型：全长0.88Mb，含有699个基因，表达650个蛋白质 2. 目的基因和载体（pGEX-6p2质粒）双酶切 混合均匀后，经离心机快速离心2s，以集中样品，37水浴1h。 3. 酶切后载体和目的基因片段回收、纯化 用DNA胶回收试剂盒回收、纯化载体和目的基因片段
8、。具体方法参照试剂盒说明书。 14 BamH （10U/L） 1 l Not （10U/L） 1 l 10 buffer 2 l 质粒/目的基因 1g ddH2O 补足体积至20l 4. 载体质粒与目的基因片段的连接 目的基因片段和载体片段按41（摩尔比）进行连 接反应，连接反应体系（25l）。 混合均匀后，经离心机瞬时，以集中样品，16反应1620h，取 出，-20保存，备作转化实验。 5. 大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化 取连接产 物2l加入已经制备的-80保存的20l XL1-Blue感受态 菌体溶液中进行转化。 15 10T4 DNA 连接酶buffer 2.5l 目的
9、基因片段 0.4pmol 载体DNA 0.1pmol T4 DNA 连接酶 1l dd H2O 补足体积至25l 6. 重组质粒的筛选 （1）将200l转化的菌液涂布于含终浓度为50g/ml Amp的LB固体培养基表面，置37培养箱30min后，倒 置平板继续培养1216h。 （2）取出培养板，观察菌落生长情况。 （3）菌落PCR 挑取选择性培养基上生长的单个菌落， 挑其一半制作菌液为PCR扩增模板，以pGEX-6p2上下 游引物为扩增引物，菌落PCR 反应总体系为20 ul，其中10Xbuffer 2.0ul，dNTP（ 2.5mmol）1ul，上游primer(20umol/L) 0.2u
10、l ，下游 primer(20umol/L) 0.2ul，Taq DNA酶(5U/ul) 0.2ul，模 板16.4ul（一般先加）。 16 7. 目的基因表达 （1）确定为阳性克隆后将剩余半个菌落挑入3 mL LB选 择性液体培养基(Amp 50g/ml)中，37继续震荡培养 14h。 （2）次日按1:50比例接种于20 mL LB液体培养基，同样 条件培养约3 h至A600达0.81.0。 17 将各反应体系混匀后瞬时离心，置于PCR仪进行PCR 扩增。PCR扩增参数具体如下：94预变性5 min；95变 性60s，54退火45s，72延伸60s，30个循环；72延伸 10 min。 （4
11、）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物 取PCR产物5l， 进行1%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统观察，判定 是否为阳性克隆，并记录结果。 8. 结果判定 在含有Amp的筛选培养基上，不带有pGEX-6p2质粒DNA的细 菌，由于无Amp抗性，不能存活；而含有pGEX-6p2空载体和含 有重组质粒（带插入基因片段的阳性重组子）的细菌均能存活。 经菌落PCR重新筛选，可获得阳性克隆。在诱导剂作用下重组质 粒在工程菌中表达目的蛋白，结合SDS-PAGE技术可鉴定蛋白表 达情况。 18 （3）加IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，30诱导培养3 h。 （4）4，5 000 rpm离心20 min，
12、弃培养液收集菌体。 （5）加入1 mL裂解液，冰浴超声6 min裂解菌体； （6）4，5 000 rpm离心20 min，分别收集上清和沉淀， 上样进行12% SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色后分析蛋 白表达形式，确定融合蛋白为可溶性蛋白或包涵体膜蛋白 。 四、注意事项 1酶切载体和目的基因的注意事项： （1）酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶 液中其他成分会干扰酶切反应。 （2）酶切要在适宜温度下进行（常为37摄氏度）。 （3）紫外光对DNA分子有切割作用，若需要从胶中回收 DNA做测定，应尽量缩短照射时间，并采用长波长紫外 线（300-360nm）。 （4）EB为强诱变剂
13、，且有毒性，配置和使用时应戴手套 ，并注意环境卫生，避免实验室污染。 19 2. 质粒载体与目的基因片段连接的注意事项 （1）在粘性末端连接时，除载体与目的基因连接构成 重组体外，还有一定数量的载体自身环化形成空载体， 这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景。为了增加重 组的比例，一般将目的DNA片段的摩尔数控制在载体 DNA摩尔数的310倍。 （2）选用品质好的T4 DNA连接酶，实验中取酶时，应 将酶放在冰盒上，用完立即放回-20冰箱保存。商品 化的连接酶反应缓冲液购买后，最好先分装，-20保 存，以减少反复冻融的次数。 20 3. 大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化的注意事 项
14、： （1）全程注意无菌操作，防止杂菌和杂DNA的污染。 （2）用于转化的质粒DNA浓度与质量要有保证，需为 共价闭合环状的DNA分子，一般情况下，DNA溶液的体 积不应超过感受态细胞体积的5%。 21 （3）连接反应的温度在37时有利于连接酶的活性，但 在此温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，因此在实 际操作时，一般采用1216，此时既可最大限度地发 挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。 4. SDS-PAGE的注意事项 （1）处理样品时需沸水浴3min左右，以除去蛋白质亚稳 态的聚合 （2）PAMF、APS等试剂有一定的神经毒性，需注意生 物安全。 （3）灌胶时不能有气泡，以免影响
15、电泳时电流的通过。 22 （3）转化温度（42摄氏度）及转化时间一定要控制准确 。 （4）转化菌涂布平板时培养时间不能超过16小时，否则 抗生素会被消耗掉，未转化菌也会生长。 五、实验意义 使同学们基本掌握基因克隆与表达技术，为进一 步的分子生物学研究奠定基础。 克隆出UU基因并表达其蛋白，为后续研究UU的 生物学特征奠定基础。 23 1童伟, 张战军, 贾天军. 肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与 定位及其重组蛋白的生物信息学分析J. 中国病原生物学杂志, 2009, 8:567-569. 2李闻文, 贺辉, 肖建华,等. 解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测 序及其在大肠埃希菌中的表达J. 中华检验医学杂志, 2003, 26(9):567-567. 24 六、参考文献 Primer5使用范例 第一步：安装：点击primer v5.exe 第二步：点击激活 在注册机中输入相应的数字并生成验证码，激活软件。 第三步：输入目的序列 file-new-DNA sequence，出现如下界面 以UUR8_0011基因为例，序
