（精品教育）课题3　血红蛋白的提取和分离

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1、2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组时代。 人类基因组：指DNA分子所携带的全部 遗传信息。 蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的 总和。主要是对蛋白质功能的研究 蛋白质分离的原理：蛋白质分离的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分 子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的 亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。 一、基础知识 （一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 2.2.凝胶：凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的 通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量 的大小，利用具有

2、网状结构的凝胶，来进行 分离。 1. 1.概念：概念： （分配色谱法分配色谱法） 3.3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程 4. 4.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理 相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部 的通道，路程较长，移动速度较慢; 相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部 的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移 动速度较快。 相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离 。 进行体外实验时，如何保证蛋白质不 会发生变性呢？ （二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。 1. 1.作用作用: : 2.2.缓冲溶液的配

3、制缓冲溶液的配制: : 通常由12 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不 同PH范围内使用的缓冲液。 3 3. . 在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是: :磷酸缓冲液, 成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？ （三）（三） 电泳：电泳： 1. 1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所 带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电

4、性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电 分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种 分子的分离。 3.3.类型类型: : 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠 （SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯 酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具 有三维网状结构的凝胶。 N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 1. 1.原

5、理：原理： SDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成 的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链， 因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDS能与各 种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDS所带负电荷 的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而掩 盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完 全取决于分子的大小。 2. SDS2. SDS作用机理作用机理: : 用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质 分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测

6、定蛋 白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量 的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定 未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量市场上有高分子量 、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂 出售。出售。 二、实验操作二、实验操作 样品处理粗分离纯化纯度鉴定 蛋白质提取和分离步骤 血血 液液 血浆血浆 水水 分分 固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细血细 胞胞

7、 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多） 血红蛋白血红蛋白 （9090） 两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 血液有哪些成分？血液有哪些成分？ （一）血红蛋白 血红蛋白血红蛋白 两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁血红素基团四个亚铁血红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素 基团，此基团可携带一分子氧 或一分子二氧化碳，血红蛋白 因含有血红素而呈红色。 （一）血红蛋白 二、实验操作二、实验操作 用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、羊的红，用猪、牛、羊的红 细胞提取血红蛋白的原因是什么？细胞提取血红蛋白的原因是

8、什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便，便 于进行于进行DNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，的提取；人的红细胞无细胞核， 结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取 血红蛋白。血红蛋白。 样品处理粗分离纯化纯度鉴定 蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 (1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤: : 洗涤目的洗涤目的: : 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化。 洗涤操作：洗涤操作： 1、采集血样。 2、低速短时间离心。 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯 化钠溶液洗涤。

9、5、低速短时间离心。 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色， 表明洗涤干净。 1.1.样品处理样品处理 （二）操作过程 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白； 离心速度过高、时间过长会使白细胞和淋 巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 注意：注意： (2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加 40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分 钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液： 离心：离心：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min。 试管中溶液层次：试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无

10、色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 (4)(4)透透 析：析： 过程：过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将 透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 2.2. 粗分离粗分离 2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作: : （1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作： 取长40

11、厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙 网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项注意事项： 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则 难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应 位置组装成一个整体。安装其他附属结构。 凝胶的选择凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨 胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即 每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称

12、取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分 溶胀后，配成凝胶悬浮液。 （2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱 柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装 均匀。 注意：注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡 会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分 离效果。 （2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 洗涤平衡洗涤平衡：装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm 高的操作压下，用300ml的 20mmol/l的磷酸

13、缓冲液（pH为 7.0）充分洗涤平衡12小时。 注意：注意： 50cm50cm高高 （2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 1、液面不要低于凝胶表面， 否则可能有气泡混入，影响液 体在柱内的流动与最终生物大 分子物质的分离效果。 2、不能发生洗脱液流干，露 出凝胶颗粒的现象。 （3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出 口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝 胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸1ml样 品加到色谱柱的顶端，滴加样品时 ，吸管管口贴着管壁环绕移动加样 ，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开

14、下端出口，使样品渗入凝胶床内 ，等样品完全进入凝胶层后，关 闭下端出口 洗脱：洗脱：小心加入pH=7.0 的 20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开 下端出口进行洗脱。 收集：收集：待红色的蛋白质接近 色谱柱底端时，用试管收集流出 液，每5ml收集一试管，连续收 集。 注意：注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面 。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 在分离过程中，如果红色 区带均匀一致的移动，说 明色谱柱制作成功 注意：注意： （三）（三）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 鉴定血红蛋白纯度。目的：目的： 1.样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放 、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化通过通过凝胶色谱法凝胶色谱法将相对分子质量较 大的杂质蛋白除去 4.纯度鉴定SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。 小结：小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 样品处理粗分离纯化纯度鉴定