《实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实 验 一 蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G-250染色法 朱新霞 Please be quiet, 上课了！ 1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质 含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。 一、实验目的： 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色. 蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收. 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml）其OD595nm值与蛋 白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量 测定。 二、实验原理： 考马斯亮蓝G-250染色法原理 465 nm595 nm
2、酸性环境下呈棕红色与蛋白质结合变蓝色 加入蛋白质 双缩脲反应： Folin-酚试剂法（Lowry法）： 紫外吸收法： 微量凯式定氮法： 其他蛋白质含量的测定方法 （1）双缩脲法： 原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH- ）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与 Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成 正比，故可以用来测定蛋白质含量. （2）Folin-酚试剂试剂 法（Lowry法） ： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液 中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原 磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝 混合物）比双缩脲法灵敏，但费时； （3）紫外吸收法： 蛋白质中T
3、rp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有 共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸 收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其 含量成正比，可用作定量测定。 简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干 扰。 （4）微量凯式定氮法： 根据蛋白质的平均含氮量为16%，因此，测 得1g蛋白氮，相当于6.25g蛋白质。 1、 实验材料：豆芽 2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计 (2)研钵 (3)离心机 (4)试管 (5)容量瓶等 3、试剂： （1）染色液：考马斯亮蓝G-250 (100mg 考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水 稀释至 1L) （2）
4、浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次分别加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水 补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀 ，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm 值，绘制标准曲线。 四、实验步骤： 制作标准曲线： 编号1 (空白 ） 234567样品 标准蛋白 (ml) 0.00.10.150.20.30.40.5 0.5ml 水 (ml) 0.50.40.350.30.20.10.0 浓度 (mg/ml) 0.00.050.07
5、50.10. 15 0.20.25C0 染色液 (ml) 55555 55 5 OD值 标准蛋白质浓度 OD值 0 样品OD值 C0 0.05 0 .075 0.1 0.15 0.20.25 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 OD6 标准曲线的制作（图） y=ax+b R2= 标准曲线的绘制 目的：得到样品中蛋白质的浓度。 首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G- 250反应,然后在595 nm处测定吸光度（OD）。 其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。 最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对 应的浓度。 称取豆芽叶片2g 研钵中加2ml水研成匀浆 转入离心管用水分三次冲
6、洗研钵，每次 2ml均转入同一离心管 等重后4000转/分离 心15分钟取上清液转入25ml容量瓶定容。 2、样品蛋白质提取： 吸取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯 亮蓝G-250 染色剂5ml，充分混匀，放置5分钟 ，测OD595nm，记录结果，查曲线，得蛋白质 浓度C0(mg/ml)。 3、测定： 分光光度技术 n利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光 谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构 分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪 器称为分光光度计. 红外吸收光谱：波长范围2.51000 m,主要用于有机化合 物结构鉴定。 紫外吸收光谱：波长范围20
7、0400 nm（近紫外区）可用 于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：波长范围400750 nm ，主要用于溶液等 的定量分析。 朗伯比尔(Lambert-bee)光吸收定律： Alg（I0/It) -lgT b c （1）A吸光度 “OD”：描述溶液对光的吸收程度； 同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光 度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。 同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异 ，在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度 法进行物质定量分析的重要依据。 I0：表示入射光强度，It ：表示光线通过溶液后的强度 。 光吸收定律： （2）T透光度：描述入射光透过溶液的
8、程度； （3）摩尔吸光系数(是溶液的特征常数)，在数值 上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在 某一波长下的吸光度；单位molL1； （4）b样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收 地，b=1cm （5）C样品浓度（mol/L） 由上式可以看出：吸光度OD与物质的浓度“C”和溶 液吸光的厚度成正比。 Alg（I0/It)=-lgTb c 分光光度计的组成和构造： （1）光源； （2）单色器 （3）吸收池； （4）接收检测放大系统(检测器)； （5）信号指示系统(显示或记录器)。 光源： n 用于可见光光源是钨灯和卤钨 ，现在最常 用的是卤钨灯（Halogen lamp），适
9、用波长范 围是3201100nm。 n 用于紫外光区的是氢灯和氘灯适用波长范 围是195400nm。 单色器： n单色器是分光光度计的心脏部分。 n把来自光源的混合光波分解为单一波长的光 n能随意改变光的波长。 n单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面 反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦 元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是 色散元件:主要是棱镜和光栅 吸收池 吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。 光学比色杯和石英比色杯两种。 光学比色杯适用波长范围是400nm2000nm ，只能 用于可见光。 石英比色杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是 最常使用的吸收池，使用波长范围是1
10、80nm 3000nm。 光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml ） 比色杯使用注意事项： 比色杯在使用前后都要彻底的清洗。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。 严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和 绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗 后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 n 检测器： 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出 来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。 显示装置：分光光度计现在已都使用数字显示，有的还 连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有 的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘
11、 图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。 偏离朗伯比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线 常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对 朗伯比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。 （1）物理性因素 难以获得真正的纯单色光。 朗伯比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导 致对朗伯比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、散射光和反 射光、非平行入射光都会引起对Beer- Lambert定律的偏离，最主要的是非 单色光作为入射光引起的偏离。
12、(2) 化学性因素 朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作 用；假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合 、互变异构、配合物的形成和与溶剂间的作用，使吸光质点的 浓度发生变化，影响吸光度。 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存 在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中 CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。 故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。 分光光度法在生化实验技术中的应用： 主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质 含量的测定、核酸含量的测定、酶活力测 定、酶催化反应动力学的研究等。 五、结果计算： 样品蛋白质含量（mg/g） = C0提取液的总体积/ 样品鲜重(g) 六、思考题： 1、简答另外四种测定蛋白质含量的方法及简要原理？并比较 几种方法的优缺点。 2、做比色测定时，标准溶液的浓度范围怎样选定？待测样品 溶液的浓度应稀释在什么范围？ 3、比色时，设一个“0”号空白试样的意义是什么？
