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1、第六章 遗传标记及其应用 第一节 遗传标记 的类型与特点 遗传标记（Genetic markers） 可以明确反映遗传多态性的生物特征。 形态标记（morphological markers 细胞学标记（cytological markers） 生化标记（biochemical markers 分子标记（molecular markers） 色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的标记 。 一、形态标记 形态标记 能够显示遗传多态性的外部形态。 如株高、叶形、育性等。 广义形态标记 水稻已鉴定出300 多个标记基因 棉花中已鉴定出160 多个突变基因。 染色体结构 (如缺失、易位、倒位、重复
2、等) 二、细胞学标记 细胞遗传学标记 能够显示遗传多态性的细胞学特征。 染色体数量（如单体、缺体、三体、四体） 缺一对5A染色体，发育成斯 卑尔脱小麦的穗型。 普通小麦 21对染色体都有其缺体，活 力较差和育性较低。 5A染色体有抑制斯卑尔脱小 麦穗型的基因 发现突变型比正常的直果曼陀罗（2n =24=12） 多一个染色体（12+ l），即11+ l 。 直果曼陀罗(Datura stramonium) 中发现球形蒴果 1910 1920 染色体长度、随体和着丝粒，反映染 色体的缺失、易位、倒位、重复 染色体结构 C带、N带、G带等，反映染色体上常 染色质与异染色质的分布 染色体核型 染色体带
3、型 三、生化标记 生化标记 贮藏蛋白、同工酶等标记 种子贮藏蛋白 白蛋白 球蛋白 醇溶蛋白 谷蛋白 不同植物，4种蛋白含量不同， 如 水稻、小麦中含有高水平的谷蛋白， 玉米中主要是醇溶蛋白 豆科作物主要是球蛋白 种子贮藏蛋白的电泳分析已广泛用于作物品种鉴别和 种子纯度鉴定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 同工酶（isozyme） 具有功能相同而结构和理化性质不同的一类酶 等位酶（allozymes） 同一基因座上的不同等位基因编码的同工酶 共显性 四、分子标记（molecular marker） 分子标记 以DNA多态性为基础的遗传标记 7、检测手段简单快捷；开发和使用成本低。 （一）分子标记的特点 1
4、、遗传多态性高； 2、多数为共显性，信息完整 3、在基因组中大量存在且均匀分布 4、选择中性 5、稳定性、重现性好 6、信息量大，分析效率高 简称RFLP标记 （二）分子标记的类型及原理 分子标记技术大体分为四大类 1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术 （in situ hybridization） 限制性片段长度多态性标记 （Restriction fragment length polymorphisms） 可变数目串联重复序列标记 （Variable number of tandem repeats） 简称VNTR标记 原位杂交 简称ISH 2、基于PCR的DNA标记 1）单引
5、物PCR标记 2）双引物选择性扩增的PCR标记 3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。 限制性酶切片段的选择性扩增 3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记 分为两类 PCR扩增片段的限制性酶切 如AFLP 如CAPs Single nucleotide polymorphism， 4、基于单核苷多态性的DNA标记 单核苷酸多态性 简称SNP 用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有 与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。 （三）主要分子标记 1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams） 限制性片段长度多态性 19
6、80，Bostein 碱基替换、插入、缺失或重 复造成某种限制性内切酶（ restriction enzymes ）酶切位 点的增加或丧失以及内切酶 酶切位点间DNA片段变化 基因组DNA序列上的变化 （1）RFLP标记的原理 （1）RFLP标记的分析步骤 单拷贝或寡拷贝 RFLP分析探针 探针来源 cDNA克隆 基因组克隆（Random Genome） PCR克隆 （3）RFLP标记的特点 优点 数目几乎无限 共显性 可以利用现有探针，具有种族特异性 RFLP标记遍及全基因组 重复性好 缺点 成本较高; 需要许多克隆探针； 一个探针只能产生一个多态位点； 所需DNA量大(515g)； 易造成
7、环境污染 随机排列的寡聚脱氧 核苷酸单链引物（ 10 个核苷酸）。 通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多 态性DNA片段。 2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA） RAPD， 随机扩增多态性DNA 1990,Williams 特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。 PCR，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Mullis等(1985) PCR反应：变性、复性、延伸。 RAPD与经典的PCR反应的区别 引物 反应条件 扩增产物 AP-PCR（Arbitrarily primed polymera
8、se chain reaction) 任意引物PCR 引物长度与一般PCR反应中的引物相当 开始阶段退火温度较低 DAF（DNA amplification fingerprinting） DNA扩增指纹 引物长度比RAPD更短，为58个核苷酸 DAF复性和延伸常用同一种温度 （2）RAPD标记的特点 优点 1）可检测未知序列的基因组DNA 2）引物无种族特异性 3）RAPD技术简单 4）单个引物可产生几个多态位点 5）通过克隆测序可转化成SCAR SCAR（Sequence Characterized Amplification Region） 特异序列扩增区域标记 缺点 1）再现性差 2）
9、显性遗传 3）存在共迁移问题 3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms） 扩增片段长度多态性 1993， Zabeau marc和Vos pieter 是对限制性酶切片段的选择性扩增 （1）AFLP标记的原理 基因组的DNA进行双酶切 人工接头连接 PCR反应的引物 凝胶电泳 AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组 中的酶切位点数量决定。 限制性酶 酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter）， 酶切频率较低的限制性酶（rare cutter） 产生易于扩增基因组DNA 限制扩增模板DNA片段的数量 3）选择扩增 AFLP
10、分析的基本步骤 1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA 2）DNA片段两端连接上特定的接头 (oligonucleotide adapters) 6） 自显影 4）聚丙烯酰胺凝胶电泳 5）凝胶转移，干胶处理 荧光标记、银染 （2）AFLP标记的特点 优点 1）数目和种类很多 2）一次PCR反应可检测多个遗传位点 3）AFLP分析模板用量少 4）分辨率高 5）假阳性低，可靠性高 6）AFLP标记多数为显性 缺点 分析成本高 DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高 甲基化敏感酶易产生假假阳性 (Variable number tandem repeat) 4、SSR（Simple Sequence Re
11、peat） 1987，Nakamura 生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列 可变数目串联重复序列 简称VNTR 小卫星（minisatellites） 微卫星（microsatellites） 简单重复序列，又称微卫星DNA 一类由16个碱基组成的基序（motif）串联重复而成 的DNA序列 如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n n代表重复次数，其大小在1060之间 DNA复制或修复过程中的分子 滑动（slippage replication） 或不等交换所致。 微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列 （1）SSR标记的原理 根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计
12、一对特异引物 ，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通 过电泳分析核心序列的长度多态性。 凝胶电泳检测 建立SSR标记的一般程序 建立基因组DNA的质粒文库 设计并合成探针，筛选重组克隆 阳性克隆DNA插入序列测序 根据SSR两侧序列设计并合成引物 PCR扩增 2）检测一个单一的多等位基因位点。 （2）SSR标记的特点 1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高 3）多数为共显性标记 使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼 的DNA序列。 4）重复性高，稳定可靠 5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻 引物设计采用24个核苷酸序列为基序（ motifs），以其不同重复次数
13、再加上几个非重 复的锚定碱基 Inter-simple sequence repeat polymorphic DNA ISSR标记 相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列 用小卫星做探针，与限制性内切酶酶切的基因组 DNA杂交，检测其多态性。 小卫星（minisatellites）标记 核心序列长度为10-60bp 常用Southern杂交方法检测 共显性遗传 5、SCAR（Sequence Characterized Amplification Region ） 特异序列扩增区域标记 一般步骤 RAPD分析 克隆片段两端测序 设计长为1824bp的引物 PCR扩增检测 高的重复性 优
14、点 6、CAPS（Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged Site ） 切割扩增多态序列标签位点技术 又称PCR-RFLP 基本步骤 特定引物PCR扩增 PCR扩增产物限制性内切酶酶切 酶切产物凝胶电泳检测 CAPs标记的优点 引物与限制酶组合非常多 CAPS标记呈共显性 所需DNA量极少 结果稳定可靠 操作简便、快捷 指基因组中长度为200500bp，且核苷酸顺序已知的 单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。 7、STS（Sequence-tagged Sites） 序列标签位点简称序标位 YAC或cosmid插入末端序列
15、 引物来源 RFLP单拷贝的探针序列 微卫星序列 表达基因序列 很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移， 且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。 8、 ESTs（Expressed sequence tags） 表达序列标签 直接与一个表达基因相关，很易于转变成STS 共显性遗传 突出优点 扩增基因开发阅读框（open reading frames, ORFs） 。 引物17-18个碱基，包括13-14 个碱基的核心区域（5的10-11 个碱基为填充区，随后正向为 CCGG，反向为AATT），核 心区域后为3个选择碱基。 9、SRAP（Sequence-related amplified
16、polymorphism） 相关序列扩增多态性 SRAP的特点 优点 1）每一反应可得大量多态位点 2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物； 3）便利、简单； 4）重复性好； 5）PCR产物可直接测序。 基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。 一般通过对PCR产物、基 因组文库、表达序列标签 （EST）文库测序而获得 10、SNP（simple nucleotide polymorphisms） 单核苷酸多态性 等位基因遗传密码的单碱基差异。 特点：数量大 第二节 分子标记的应用 一、遗传多样性分析 A Chromosome Map of Tomato 二、 遗传图谱的构建 （一）作图群体的建立 1、亲本的选配 亲本选择
